Artículo Original
Capacidad de procesamiento de los nanofiltros empleados en la purificación de la proteína recombinante del dominio de unión al receptor
del coronavirus tipo 2 del síndrome respiratorio agudo severo
Processability
of nanofilters used in the purification of the
recombinant receptor-binding domain protein of severe acute respiratory
syndrome type 2 coronavirus
Ivis Regalado-Fonseca1,2* ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7989-8225
Lourdes Hernández-de la Rosa1 ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4041-0445
Martha R. Castro-Figueroa1 ORCID:
https://orcid.org/0009-0000-4016-4120
Lourdes M. Zumalacárregui-de Cárdenas2 ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6921-737X
1
Centro de Inmunología Molecular, La Habana, Cuba.
2 Universidad
Tecnológica de La Habana ¨José Antonio Echeverría¨, La Habana, Cuba.
Autor para correspondencia: ivisr@cim.sld.cu
RESUMEN
En el Centro de Inmunología Molecular se producen el ingrediente
farmacéutico activo y la materia prima biológica empleados para la formulación
de las vacunas SOBERANAS®. El antígeno de estas vacunas es la
proteína del dominio de unión al receptor del coronavirus tipo 2 del síndrome
respiratorio agudo severo. La producción de esta proteína recombinante se basa
en el cultivo de células de ovario de hámster chino en biorreactores tipo
tanque agitado. El proceso tecnológico a escala industrial consta de varias
etapas: preparación de medios de cultivo y soluciones, fermentación,
clarificación de sobrenadante y purificación. En los procesos biotecnológicos
derivados de líneas celulares de origen animal, la contaminación viral endógena
o adventicia constituye un riesgo potencial. Por tal motivo, en el proceso de
purificación se emplea un paso específico para la remoción viral mediante la
nanofiltración. Los nanofiltros empleados son
materiales desechables que influyen significativamente en el costo del proceso.
Actualmente se desconoce la capacidad de procesamiento de los nanofiltros en el proceso de purificación en cuestión, siendo
el objetivo de la presente investigación con vistas a reducir los costos de
producción. Se determinó la capacidad de procesamiento de los filtros Virosart CPV, siendo de 239,74 g/m2
(71,67% de saturación) y 1.259 g/m2 (67,82% de saturación) para la
especie dímero y la mezcla, respectivamente. Se determinó la disminución del
costo de producción de la etapa de nanofiltración, que representa una
disminución del 54,85% del costo de filtración de la especie dímero y un 25% de
la mezcla.
Palabras clave: filtros;
filtración por membranas; nanoporos; vacunas.
ABSTRACT
The active pharmaceutical ingredient and the biological
raw material, used for the formulation of the SOBERANA® vaccines,
are produced at the Molecular Immunology Center. The antigen of these vaccines
is the receptor-binding domain protein of the severe acute respiratory syndrome
type 2 coronavirus. The production of this recombinant protein is based on the
culture of Chinese hamster ovary cells in stirred tank bioreactors. The
technological process on an industrial scale consists of several stages:
preparation of culture media and solutions, fermentation, clarification of
supernatant and purification. In biotechnological processes derived from cell
lines of animal origin, endogenous or adventitious viral contamination is a
potential risk. For this reason, a specific step for viral removal by
nanofiltration is used in the purification process. The nanofilters used are
disposable materials that significantly influence the cost of the process. The
processing capacity of the nanofilters in the purification process in question
is currently unknown, being the objective of the present investigation with a
view to reducing production costs. The processing capacity of the Virosart
CPV filters was determined to be 239.74 g/m2 (71.67% saturation) and 1,259 g/m2
(67.82% saturation) for the dimer species and the mixture, respectively. The
decrease in the production cost of the nanofiltration stage was determined,
representing a 54.85% decrease in the filtration cost for the dimer species and
a 25% decrease for the mixture.
Keywords: filters; membrane
filtration; nanopores; vaccines.
Recibido: 18 de septiembre de 2023
Aceptado: 18 de marzo de 2024
Introducción
En los procesos biotecnológicos derivados de líneas celulares de origen
animal, la contaminación viral es un riesgo. Para garantizar la máxima
seguridad, la directriz reguladora de la Conferencia Internacional sobre
Armonización recomienda implementar tecnologías que remuevan virus en los
procesos de fabricación de productos para uso en humanos; de ahí la importancia
de demostrar la capacidad para eliminar o inactivar este tipo de contaminantes
en los procesos biotecnológicos,(1)
y garantizar la salud de los pacientes, una vez el producto se encuentre
disponible en el mercado.(2)
Los virus presentes en los procesos biotecnológicos se dividen en tres
categorías: adventicios, endógenos y no endógenos. Los virus adventicios son
introducidos durante el proceso de fabricación mediante materias primas
contaminadas o por malas prácticas de producción, mientras que los virus
endógenos se originan por la línea celular empleada para expresar el producto.
Los virus no endógenos provienen de fuentes externas presentes en el
banco maestro de células.(1)
Los retrovirus murinos son una preocupación clave en las células de
ovario de hámster chino (CHO). A menudo se emplea para estudios de eliminación
viral, el virus xenotrópico de leucemia murina (X-MuLV).(1) A
pesar de que en los procesos biotecnológicos que se emplean células CHO, no se
ha reportado la presencia del virus diminuto de ratón (MVM), este es un
contaminante potencial debido a su pequeño tamaño, por lo que es difícil
eliminar en los procesos de nanofiltración. El MVM se emplea para realizar los
estudios de retos virales con el objetivo de demostrar la robustez del proceso.
Barone y colaboradores, reportaron una contaminación
con el MVM, en este caso el proceso no contenía materias primas derivadas de animales.(3) Este virus puede no ser
detectable, incluso con un control establecido de roedores, y persistir en el
medio ambiente y en las materias primas mucho tiempo después de su vertimiento.(3)
La
filtración de virus se considera una de las herramientas de eliminación de
virus más eficaces, robustas y ampliamente aplicables, debido a que elimina los
contaminantes virales en función de un mecanismo de exclusión por tamaño.(4)
En la filtración de virus, en los procesos de purificación de proteínas, las
pequeñas cantidades de agregados, principalmente en el intervalo de tamaño de
16-30 nm, son uno de los principales contaminantes.(5) El
rendimiento del filtro depende en gran medida de las condiciones de operación
(presión transmembrana y flujo).(6) La presencia de agregados en la solución proteica puede disminuir la
capacidad de procesamiento del filtro; para reducir el impacto de estas
variaciones y proteger el filtro empleado para la eliminación de partículas
virales, es recomendado el uso de prefiltros.(5)
Estos filtros se aplican en procesos biotecnológicos de separación, en
los campos médico y farmacéutico, remoción de sales, entre otros.(7)
Generalmente esta operación no requiere de la adición de productos químicos
agresivos, se puede realizar a temperatura ambiente, los filtros poseen una
membrana polimérica que retiene los contaminantes presentes en el producto y el
proceso es eficiente. Las propiedades de una membrana polimérica dependen
principalmente de dos factores: la naturaleza físico-química del polímero y el
método de síntesis de la misma.(7)
En los últimos años, muchos de los polímeros cargados positivamente
(catiónicos) han demostrado propiedades antivirales y que son muy adecuados
para la funcionalización de membranas poliméricas.(8)
Diversos autores han realizado estudios sobre la capacidad de
procesamiento de filtros empleados para la eliminación de partículas virales en
la industria biotecnológica. En el proceso de purificación del anticuerpo
monoclonal Nimotuzumab, que posee una masa molar de
150 kg/mol, la capacidad másica de procesamiento de los filtros Virosart CPV es de 995 g/m2;(9)
mientras que para el anticuerpo monoclonal Racotumomab,
que posee igual masa molar, se obtuvo una capacidad de procesamiento de 1.142
g/m2.(10)
También se obtuvo una capacidad de procesamiento de los filtros Virosart CPV de 138,53 g/m2 para la
eritropoyetina humana recombinante, la cual posee una masa molar de 34 kg/mol.(11)
Además, Alsop y colaboradores, reportan una capacidad
de procesamiento de los filtros Virosart
MAX-HF (membrana de fibra hueca) de 1.350 g/m2 para un anticuerpo
monoclonal con masa molar de 200 kg/mol y presencia de agregados inferior al
5%.(12) Bolton y colaboradores, reportan para los filtros Virosart CPV, una capacidad másica de procesamiento
de 26.400 g/m2 para un anticuerpo monoclonal de 0,15 kg/mol;(13)
siendo superior la capacidad de procesamiento para este último, debido a que
posee menor tamaño molecular. También se emplean otros tipos de filtros para la
eliminación de partículas virales.
Los
filtros Virosart CPV se emplean en la
purificación de anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos o pequeñas
proteínas recombinantes (<150 kg/mol)(14) para asegurar que el
producto final no posea contaminación viral; se utilizan al final del proceso
de purificación para la filtración de virus en productos biofarmacéuticos,
donde la pureza del producto es la más alta y el bloqueo del filtro empleado
para la eliminación de virus, debido a contaminantes (ADN, agregados y
lipoproteínas), es más bajo que en la etapa de purificación intermedia,(15,16)
ya que pequeñas cantidades pueden ser suficientes para causar un bloqueo
prematuro de dicho filtro.(15) La capacidad de retener más de 4 log
de los virus pequeños sin envoltura no se correlaciona necesariamente con la
disminución del flujo.(17) Estos filtros ofrecen la mayor seguridad
viral en todo el perfil de disminución de flujo hasta el 90%,(14,15)
por lo que son empleados en el proceso de purificación del anticuerpo
monoclonal Nimotuzumab(9) y de la proteína del dominio de unión al receptor (RBD,
por sus siglas en inglés) del coronavirus tipo 2
del síndrome respiratorio agudo severo, la cual presenta una cola de histidina.
Los
anticuerpos anti-RBD presentan una alta calidad y funcionalidad, lo cual
respalda el hecho de que la proteína recombinante RBD sea considerada como
antígeno vacunal. El uso de RBD monomérica como antígeno ha inducido buena
respuesta de anticuerpos en varios modelos animales, sin embargo, el diseño de
RBD dimérico produce títulos de anticuerpos de 10 a
100 veces más altos.(18) La
tecnología de vacuna conjugada ha logrado una sólida respuesta neutralizante.
Múltiples copias del antígeno RBD se unen químicamente a una proteína portadora
inmunogénica, la que permite una respuesta de anticuerpos potenciada.
El 11
de marzo de 2020 se detectaron los primeros casos de COVID-19 en Cuba.(19) Con el incremento del número
de personas infectadas, los científicos cubanos empezaron a realizar
investigaciones con el objetivo de obtener una vacuna para enfrentar esta
enfermedad. El Centro de Inmunología Molecular (CIM) se dedicó a la producción
del ingrediente farmacéutico activo y la materia prima biológica empleados para
la formulación de las vacunas SOBERANAS®.
En diciembre del año 2020, comenzó en la planta de
producción Antyter, la producción de la proteína RBD
(aa319-541), la cual presenta una cola de histidina; para ello se adecuaron las
condiciones para emplear el equipamiento existente en la planta teniendo en
cuenta las exigencias regulatorias.(1) El proceso de purificación de la proteína RBD
(aa319-541) comienza con la filtración del sobrenadante proveniente de
fermentación, cuyo objetivo es eliminar
células, agregados y restos celulares presentes. Luego se realiza un paso de
captura para aislar, concentrar y estabilizar el producto de interés, con el
cual también se puede lograr la remoción de los contaminantes críticos.
Seguidamente se efectúa una cromatografía de exclusión molecular, con el
objetivo de preparar las condiciones para la cromatografía de intercambio
catiónico, en la cual se eliminan los contaminantes (tales como endotoxinas,
ADN y agregados de la proteína) presentes en el producto.(20) A
continuación, se realiza otra cromatografía de exclusión molecular (se emplea
la matriz cromatográfica Superdex 200 pre grade) como
paso de purificación final de la proteína(21) y se separan los dos
productos de interés (el dímero y la mezcla de monómero y dímero). Luego se
ejecuta la nanofiltración para eliminar las partículas virales que puedan estar
presentes, empleando un filtro de 20 nm de diámetro de corte. Al producto
obtenido en el paso anterior se le añade una solución ajustadora para
estabilizar la proteína para su posterior almacenamiento y se microfiltra con el empleo de un filtro de 0,2 μm hacia una bolsa estéril y apirogénica.(20) De acuerdo
con las exigencias regulatorias,(1) el paso de nanofiltración se estableció para demostrar la no existencia de
partículas virales en el producto. Sin embargo, al ser un producto nuevo, se
desconocía la capacidad de procesamiento de los filtros utilizados para la
eliminación de partículas virales en el proceso de purificación; información
necesaria para su mejor explotación y reducción del costo de producción. Por
consiguiente, los objetivos de este trabajo fueron determinar la capacidad de
procesamiento de los filtros empleados para la eliminación de virus en el
proceso de purificación de las vacunas SOBERANAS® y disminuir el costo de
producción de la etapa de filtración.
Materiales
y Métodos
Procesamiento de la información histórica
Se analizaron nueve parámetros de
calidad, con 27 registros de cada uno (muestras). Se empleó la estadística
descriptiva básica: media, mediana, desviación estándar, coeficiente de
variación (CV), mínimo, máximo, y sesgo y curtosis estandarizados. Se empleó el
software Statgraphics Centurion
XVII versión 17.2.00.
Determinación de la capacidad de procesamiento de los filtros empleados
para la eliminación de virus a escala de laboratorio
Para
el enjuague inicial, se añadió en el reservorio 20 mL
de la solución tampón de Superdex (Na2HPO4
8 mmol/L, NaCl 150 mmol/L, pH 7,4 y conductividad de 12-18 mS/cm),
se presurizó a 200 kPa (presión de trabajo) y se filtró la solución durante 15
min, para esto se empleó un tanque de nitrógeno, un manómetro digital (0 - 4000 psi, USG, Estados
Unidos) y un regulador de presión (IR2010-F02, SMC, Japón). Luego se despresurizó el
sistema, se añadió el producto al reservorio (dímero o mezcla de monómero y
dímero de la proteína RBD), se volvió a presurizar y se filtró el producto a
presión constante hasta que se agotó.(10)
Se emplearon los filtros Virosart Minisart CPV.
La
capacidad volumétrica se determinó mediante dos métodos: a partir del cálculo
del flux y calculando Vmáx, empleando la
ecuación 1. El flux se determinó con los datos de volumen filtrado recogidos
cada un minuto, durante la filtración, mediante la ecuación 2. Para la
cuantificación del volumen filtrado se empleó la balanza técnica (Extend, Sartorius Stedim Biotech, Alemania).
ecuación
(1)
ecuación (2)
Donde:
V: volumen de producto filtrado
t: tiempo
A: área de filtración
Vmáx:
volumen máximo a procesar por filtro
Qo:
flujo volumétrico inicial
En el método a partir del cálculo
del flux se realizaron dos gráficos: t vs flux y flux vs % saturación, para la determinación
del volumen máximo a procesar por el filtro y el comportamiento de la
saturación en el filtro.
En el método de determinación de Vmáx se elaboró un gráfico de tiempo/volumen en
función del tiempo (t/v vs t). Por recomendación de la literatura, se
desprecian los primeros 5 min de experimentación.(22,23)
El ajuste de los datos al modelo a una línea recta permitió determinar Vmáx del inverso de la pendiente.
Determinación
del porcentaje de saturación
El porcentaje de saturación se determinó mediante
la ecuación 3.(10)
ecuación (3)
Donde:
% saturación: porcentaje de
saturación
Qi:
flujo volumétrico inicial
Qf:
flujo volumétrico final
Determinación
de la capacidad másica de procesamiento
La capacidad másica de procesamiento de los filtros
empleados para la eliminación de partículas virales se determinó con la
ecuación 4.
ecuación (4)
Donde:
CP:
capacidad de procesamiento
Vf: volumen total filtrado
Cp:
concentración de proteínas
Ao: área del filtro de prueba
Determinación del recobrado
El recobrado es un parámetro de
desempeño de cada etapa de un proceso de purificación de proteínas. (10)
Se determinó mediante la ecuación 5. La masa de proteína obtenida en el paso de filtración para
la eliminación de virus se obtuvo mediante la técnica de espectrofotometría, en
la cual se midió la densidad óptica a 280 nm con el empleo de un
espectrofotómetro UV-VIS (Génesis 10S, Thermo
Scientific, Estados Unidos).
ecuación
(5)
Donde:
R:
recobrado (%)
m salida:
masa de proteína al finalizar el paso de filtración para la eliminación de
virus
m entrada: masa de proteína al iniciar el paso de filtración
para la eliminación de virus
Determinación de la capacidad de procesamiento de
los filtros empleados para la eliminación de partículas virales a escala de
producción
Con la capacidad másica de
procesamiento de los filtros obtenida a partir del flux, se calculó la masa
máxima que se puede procesar a escala de producción, debido a que la
concentración del producto de entrada al proceso de filtración es variable. El
filtro empleado en el proceso productivo tiene un área de 0,70 m2.
Determinación del costo de producción
Se realizó una comparación entre
el costo de producción para la etapa de filtración del proceso de producción
actual y del que surge con la implementación de las nuevas condiciones. Con las nuevas condiciones, se procesan
con un filtro ocho lotes de dímero, y de igual forma, con un filtro se procesan
ocho lotes de mezcla.
Resultados
y Discusión
En la Tabla 1 se muestran los estadígrafos determinados para cada
variable analizada en los pasos de exclusión molecular y filtración para la
eliminación de virus.
Tabla 1. Indicadores estadísticos de las variables de los pasos de exclusión
molecular (Superdex) y filtración para la eliminación
de virus.
|
Variables |
Mínimo |
Máximo |
Media |
Mediana |
Sesgo estandarizado |
Curtosis estandarizada |
Desviación estándar |
CV (%) |
|
cdim |
0,69 |
1,86 |
1,23 |
1,13 |
0,86 |
-1,13 |
0,36 |
29,05 |
|
mdim |
6,32 |
30,34 |
12,52 |
10,06 |
3,62 |
2,52 |
6,28 |
50,14 |
|
rdim |
77,83 |
100 |
93,80 |
93,87 |
-1,82 |
1,49 |
0,05 |
5,69 |
|
pdim |
62,31 |
100 |
97,03 |
98,11 |
-10,41 |
26,38 |
0,07 |
7,28 |
|
cmezfv |
0,89 |
2,64 |
1,62 |
1,61 |
1,24 |
0,88 |
0,38 |
23,37 |
|
mmez |
14,54 |
65,92 |
31,77 |
28,67 |
2,82 |
2,58 |
11,13 |
35,04 |
|
rmezfv |
80,67 |
100 |
93,55 |
92,53 |
-1,65 |
-0,06 |
0,06 |
6,56 |
|
pmmez |
73,53 |
97,68 |
90,82 |
91,79 |
-4,97 |
8,82 |
0,04 |
4,90 |
|
pdmez |
2,32 |
26,47 |
9,00 |
8,15 |
5,05 |
8,81 |
0,05 |
49,91 |
cdim: concentración de la especie dimérica en el paso Superdex; mdim: masa de la
especie dimérica en el paso Superdex;
rdim: recobrado
de la especie dimérica en el paso filtración para la
eliminación de virus; pdim: pureza de la especie dimérica
en el paso Superdex; cmezfv:
concentración de la mezcla en el paso
filtración para la eliminación de virus; mmez: masa
de la mezcla en el paso Superdex; rmezfv:
recobrado de la mezcla en el paso filtración para la eliminación de virus; pmmez: porcentaje de la especie monomérica presente en la
mezcla en el paso Superdex; pdmez:
porcentaje de la especie dimérica presente en la
mezcla en el paso Superdex. CV: coeficiente de
variación.
Se analizaron los lotes de mezcla y dímero producidos en los años 2021 y
2022. Las variables que presentaron valores de sesgo estandarizado y curtosis
estandarizada fuera del intervalo entre -2 y 2, poseen desviación significativa
de la normalidad, en este caso son: masa de la especie dimérica
en el paso de Superdex (mdim),
pureza de la especie dimérica en el paso de Superdex (pdim), masa de la
mezcla en el paso de Superdex (mmez),
porcentaje de la especie monómero obtenida en la mezcla en el paso de Superdex (mmez) y porcentaje de
la especie dímero en la mezcla obtenida en el paso de Superdex
(pdmez). Las variables masa de la especie dimérica en el paso de Superdex (mdim) y porcentaje de la especie dímero presente en la
mezcla (pdmez) poseían coeficiente de variación
superior al 40%, por lo que presentan una gran variabilidad. Los coeficientes
de variación se consideran bajos cuando son inferiores al 10% y muy altos
cuando son superiores al 40%.(24) La variación de la masa de
proteína es común en operaciones donde predomina un elevado componente manual
(cada turno de trabajo tiene un estilo de operación propio) y donde existe una
variabilidad en la expresión de la proteína de interés durante el cultivo
celular en modo de perfusión.(25) Al inicio de la etapa de
fermentación hay poca cantidad de células y, por tanto, la concentración del
producto es baja. Con la adición de nutrientes al fermentador y el ajuste de
las condiciones del cultivo se logra que la cantidad de células vaya aumentando
por día hasta que se alcanza la máxima concentración de células de manera
estable en el fermentador. En esta condición se obtiene una mayor concentración
de producto con respecto al inicio de la fermentación.(25)
Existe variabilidad en el porcentaje de la especie dimérica
presente en la mezcla, por lo que el proceso de separación del dímero y la
mezcla se debe continuar perfeccionando, siendo esta una oportunidad de mejora
en el proceso de purificación de la proteína RBD (aa319-541). También es
necesario que el personal reciba, con frecuencia, una capacitación para
disminuir las desviaciones en el proceso, que puedan estar asociadas al
personal.
Determinación
de la capacidad de procesamiento del filtro empleado para la eliminación de
partículas virales presentes en la especie dimérica y la mezcla
En las Figuras 1 y 2 se muestran la evolución del flux y el porcentaje
de saturación del filtro durante la filtración de la especie dimérica y de la mezcla de la proteína RBD (aa319-541),
respectivamente, empleando el filtro Virosart Minisart CPV. Se observó que los perfiles de flux y
saturación de la membrana (%), de las corridas 1 y 2 de la mezcla, son
similares.
Fig. 1. Evolución del flux y
porcentaje de saturación (%) durante la filtración para la eliminación de
partículas virales en la especie dimérica de la
proteína RBD (aa319-541) que posee una cola de histidina.
Fig. 2. Evolución del flux y
porcentaje de saturación (%) durante la filtración para la eliminación de
partículas virales en la mezcla de la proteína RBD (aa319-541) que posee una
cola de histidina. En la Tabla 2 se muestran los resultados de las corridas 1 y 2 de la
especie dímero y de la mezcla. Las corridas experimentales de la especie dímero
se realizaron con el mismo lote de producto obtenido en el paso de exclusión
molecular (Superdex), con concentración (1,73 mg/mL)
y pureza (dímero: 62,31 % y monómero: 37,67 %). El volumen de filtrado fue
levemente superior en la corrida 2 y la operación de filtración se realizó en
un menor tiempo. Este resultado puede estar asociado a la variabilidad entre
filtros, lo cual no afectó su desempeño, pues se logró saturar el mismo hasta
el 70% de su capacidad; otros autores demostraron que estos filtros ofrecen
una gran seguridad viral en todo el perfil de disminución de flujo hasta el 90%.(15,16)
Los filtros Virosart
Minisart CPV poseen un tamaño de poro uniforme
de 20 nm aproximadamente(16) y una pequeña variación en la
uniformidad del tamaño de poros puede provocar cambios en la capacidad de
procesamiento del filtro. La capacidad de procesamiento promedio de RBD (posee
una cola de histidina) hasta el 70% de saturación de la membrana fue 389 g/m2.
Teniendo en cuenta que el área del filtro en la escala de producción es 0,70 m2,
se puede filtrar un promedio de 272,39 g de la especie dímero por cada filtro. Los
gramos que se filtran por unidad de área de filtración no son una
especificación establecida para cada filtro. Este parámetro depende de diversos
factores como son el tamaño del producto, la concentración del producto, la
concentración de sales, la pureza (presencia de agregados, contaminantes),(5) por ello se estudia para cada producto, siendo el objetivo de esta
investigación. Las corridas experimentales de mezcla también se realizaron con el mismo
lote de producto obtenido en el paso de exclusión molecular (Superdex), con concentración (2,08 mg/mL) y pureza (dímero:
2,32 % y monómero 97,68 %). El volumen de filtrado y el tiempo de la operación
de filtración fue similar en ambas corridas. La capacidad de procesamiento
promedio fue 603,40 g/m2 (71,54 % de saturación), teniendo en cuenta
que el área del filtro en la escala de producción es 0,70 m2 se
pueden filtrar 422,40 g de mezcla por cada filtro como promedio. Tabla 2. Resultados de la filtración para la eliminación de virus de las
corridas 1 y 2 de la especie dimérica y la mezcla. Dímero Mezcla Corrida 1 Corrida 2 Prom DE CV (%) Corrida 1 Corrida 2 Prom DE CV (%) Volumen total
filtrado (mL) 104,11 120,82 112,46 10,82 10,51 143,25 146,86 145,20 2,55 1,76 Tiempo total
(min) 270,00 260,00 265 7,07 2,67 205,00 194,00 199,50 7,78 3,90 Flujo inicial
(mL/min) 0,77 0,88 0,83 0,08 9,43 1,02 1,01 1,015 0,01 0,70 Flujo final
(mL/min) 0,24 0,26 0,25 0,01 5,66 0,24 0,34 0,29 0,07 24,38 Saturación de la
membrana (%) 69,74 70,91 69,95 0,83 1,18 77,00 66,08 71,54 7,72 10,79 Capacidad de
procesamiento (g/m2) 360,22 418,04 389,13 40,89 10,51 595,90 610,90 603,40 10,61 1,76 Masa de proteína
a aplicar por filtro (g) 252,15 292,63 272,39 28,62 10,51 417,14 427,66 422,40 7,44 1,76 Prom Prom: promedio. DE: desviación
estándar. CV: coeficiente de variación. Luego de realizadas las dos corridas
experimentales de la especie dímero, se realizó una tercera y se empleó otro
lote de producto, con concentración (1,56 mg/mL) y pureza (dímero: 96,99% y
monómero: 2,92%), siendo los valores de pureza diferentes. Los valores de
concentración de las tres corridas son elevados en comparación con los valores
de mínimo (0,69 mg/mL) y media (1,23 mg/mL) obtenidos en este proceso; se
realizó la investigación con valores cercanos al máximo (1,86 mg/mL). Se pudo
saturar el filtro hasta el 90%, solamente en la última corrida, debido a la
poca disponibilidad de producto. Se apreció que en las corridas 1 y 2, a partir
del 40% de saturación, cambió el patrón de comportamiento de la curva (punto de
inflexión) y comenzó a saturarse más rápido el filtro (Fig. 1). Mientras que,
en la última corrida se aprecia una curva con tendencia al aumento,
prácticamente de forma lineal, lo cual puede estar asociado a la diferencia de
pureza entre los lotes empleados.(5) En la última corrida el porcentaje de la especie dímeros es superior,
esta molécula es de mayor tamaño que el monómero, por lo que se esperaba que la
saturación del filtro se alcanzara más rápido, como sucedió, pues influye la
pureza del producto en la saturación del mismo.(5) Otros factores
que afectan la saturación del filtro son la concentración de proteína y de
sales.(5) Se obtuvo el 71,67% de saturación a los 180 min, mientras
que en las corridas 1 y 2 los valores alcanzados fueron 69,74% y 74,32%, a los
270 min. Al igual que en el caso de la especie dímero, luego de haber realizado
las dos corridas experimentales de la mezcla, se realizó una tercera, en la
cual se empleó otro lote de producto con concentración (2,64 mg/mL) y pureza
(monómero: 91,53% y dímero: 8,48%), siendo los valores de pureza diferentes. Se
obtuvo que cuando se trabajó con la concentración cercana a las máximas
obtenidas en el proceso (2,64 mg/mL), menores fueron los valores de disminución
de flujo inicial y se demoró más en alcanzar valores próximos al 70% de saturación
del filtro. Se alcanzó el 67,82 % de saturación del filtro, no fue posible
llegar hasta el 90% por la poca disponibilidad de producto, como se mencionó
anteriormente. Se apreció que en las corridas 1 y 2, a partir del 26% de
saturación, cambió el patrón de comportamiento de la curva (punto de inflexión)
y comenzó a saturarse más rápido el filtro (Fig. 1). Mientras que, en la última
corrida se apreció una curva con tendencia al aumento, prácticamente de forma
lineal, lo cual puede estar asociado a las diferencias de pureza y
concentración entre los lotes empleados; se apreció un comportamiento similar
al obtenido en la filtración de la especie dimérica. En la última corrida de la mezcla, el porcentaje de monómeros es
inferior. Esta molécula posee menor tamaño que la especie dímero, por lo que se
esperaba que alcanzara más rápido el 70% de saturación del filtro, pero en este
caso no ocurrió. El lote empleado poseía una mayor concentración (2,64 mg/mL)
que el lote de las corridas 1 y 2 (2,08 mg/mL), por lo que la relación altas
concentraciones y menores valores de pureza de la especie monómero pudiera
influir en el aumento del porcentaje de saturación. Se obtuvo el 67,82% de
saturación a los 500 min, mientras que en las corridas 1 y 2 se obtuvieron 77,00%
y 66,08%, a los 205 min y 194 min, respectivamente. En la Tabla 3 se reportan los parámetros de los modelos matemáticos de
las tres corridas experimentales de la especie dímero y de la mezcla, obtenidos
al graficar t/v vs t, donde el inverso de la pendiente corresponde a Vmáx.
En la corrida 3 se obtuvo, por este método, que el filtro empleado a escala de
laboratorio puede procesar un volumen máximo de 153,85 mL, para una masa de 240
g a escala de proceso; mientras que, en las corridas 1 y 2 se procesan 320,37 g
y 393,18 g, respectivamente. Se observa que la capacidad de procesamiento del filtro dependió de la
pureza y se corresponde con los resultados obtenidos por Namilia
F;(5) en la última corrida de dímero, el producto poseía mayores
valores de pureza, pues el porcentaje de dímeros es de 96,99% y, en estas
condiciones, el filtro es capaz de procesar una menor cantidad de masa de la
proteína RBD que posee una cola de histidina, lo cual estuvo asociado al
superior tamaño de la molécula dímero con respecto al monómero. En el caso de la mezcla también se observó que la capacidad de
procesamiento del filtro depende de la pureza y la concentración del producto
filtrado, corroborando lo reportado por Namilia F(5). En las corridas 1 y 2 el
producto poseía mayores valores de pureza, pues el porcentaje de monómero es de
97,68% y el filtro fue capaz de procesar una menor cantidad de masa de la
proteína RBD que posee una cola de histidina. Tabla 3. Parámetros de los modelos matemáticos de las tres corridas experimentales
del dímero y de la mezcla. Los coeficientes de correlación ajustados de
los tres modelos obtenidos (dímero y mezcla) son superiores al 95%, excepto en
la corrida 1 de mezcla; pero el estadígrafo de Durbin-Watson (DW) es inferior a
1, en todos los casos y su valor P es de cero (menor que 0,05), por lo que
existe una posible correlación en serie entre los residuos al nivel de
confianza del 95%. Este valor de DW implica que puede existir subestimación del
nivel de significación estadística. En la Tabla 4 se reportan los resultados de ambos métodos, tanto para la
especie dímero como para la mezcla. Se eligió la capacidad de procesamiento del
filtro obtenida a partir del cálculo del flux, atendiendo al resultado de la
poca validez estadística del modelo lineal discutido anteriormente. En el caso
de la especie dímero se escogió la capacidad de procesamiento del filtro
obtenida en la corrida 3 (239,74 g/m2) para un 71,67% de saturación
de la membrana, debido a que poseía mayores valores de pureza, similares a los
que generalmente se obtuvieron en el proceso productivo, siendo la mediana de
98,11% de dímero. Se dejó aproximadamente un 20% de seguridad, pues no se ha
realizado aún el reto viral de los filtros empleando este producto. Estos
filtros también son utilizados en el proceso de purificación de Nimotuzumab y el reto viral realizado reportó que el flux
se redujo en 4,33 veces con respecto a las corridas en blanco(9)
y es casi cero cuando la saturación de la membrana alcanza el 90%. Se demostró
que remueve más de 4 log para perfiles de saturación de la membrana hasta un 90%.(9) En el caso de la mezcla se escogió la capacidad de procesamiento del
filtro obtenida en la corrida 3 (1.259 g/m2) para un 67,82% de
saturación de la membrana, debido a que poseía valores de pureza, similares a
los que mayormente se obtuvieron en el proceso productivo, siendo la mediana de
91,79% de monómero en la mezcla y la concentración de RBD fue la máxima
alcanzada en el proceso (2,64 g/L). Se dejó aproximadamente un 20% de seguridad,
pues no se ha realizado aún el reto viral de los filtros empleando este
producto, como se mencionó anteriormente. Tabla 4. Resultados de capacidad de los filtros por los métodos de Vmáx
y a partir del flux para el dímero y la mezcla En el proceso de purificación del anticuerpo monoclonal Nimotuzumab, la capacidad másica de procesamiento de los
filtros Virosart CPV es de 995
g/m2,(9) siendo este
valor inferior a la capacidad de procesamiento de la mezcla (1.259 g/m2).
Este resultado es de esperarse debido a que el anticuerpo monoclonal posee una
masa molar de 150 kg/mol, superior a la especie monomérica de la proteína RBD
(31 kg/mol) y ambos productos poseen pureza por encima del 90%. Se obtuvo una
capacidad de 239,74 g/m2 en el dímero de la proteína RBD (62 kg/mol,
este resultado es menor al obtenido para el Nimotuzumab(9)
(se emplea un prefiltro) y pudiera estar ocasionado
por una mayor presencia de contaminantes en el producto dímero de la proteína
RBD, pues esto provoca una disminución en la capacidad de procesamiento de los
filtros y, en estos casos, se recomienda el empleo de prefiltros en el proceso.
Este resultado también puede estar ocasionado por el empleo de diferentes
tampones en los procesos comparados. En el caso de la proteína RBD se utiliza
el tampón de Superdex (Na2HPO4
8 mmol/L, NaCl 150 mmol/L, pH 7,4 y conductividad de 12-18 mS/cm),
mientras que en el Nimotuzumab(9) se emplea el Tris ácido
clorhídrico 20 mmol/L, pH 8 y conductividad de 0,9-1,5 mS/cm.
El aumento de la concentración de sales reduce la interacción virus-membrana y
provoca la disminución del flujo.(5) Los filtros Virosart CPV también
se han empleado en otros procesos de purificación, como es el caso del
anticuerpo monoclonal Racotumomab,(10) que
posee una masa molar de 150 kg/mol y para el que se obtuvo una capacidad másica
de procesamiento de 1.142 g/m2, siendo este resultado cercano al
obtenido para el Nimotuzumab.(9) Los
resultados son semejantes debido a que ambos productos son anticuerpos
monoclonales, presentan similares masas moleculares y las purezas son
superiores al 90%. Sin embargo, este valor es superior al obtenido para el
dímero de la proteína RBD y ligeramente inferior a la mezcla. La capacidad de procesamiento de la eritropoyetina humana recombinante
(masa molar de 34 kg/mol) es de 138,53 g/m2 al emplear los filtros Virosart CPV,(11)
lo que resulta inferior a las capacidades obtenidas en esta investigación. La
obtención de un valor de capacidad de procesamiento superior, en el caso de la
RBD, pudiera estar ocasionado por una menor presencia de contaminantes y de
agregados en el producto de RBD (dímero y mezcla), pues la nanofiltración se
ubica al final del proceso de purificación. Sin embargo, para la eritropoyetina
humana recombinante, la nanofiltración se ubica en la etapa de purificación
intermedia, cuando el producto intermedio tiene mayor contenido de
contaminantes. Alsop y colaboradores, reportan una capacidad de procesamiento de los filtros
Virosart MAX-HF (membrana de fibra hueca) de 300 L/m2 (1.350 g/m2)
para un anticuerpo monoclonal con masa molar de 200 kg/mol y presencia de
agregados inferior al 5%.(12) Este resultado es superior al obtenido
para la proteína RBD (dímero y mezcla) con el empleo de los filtros Virosart CPV (membrana plana), a pesar de que este anticuerpo monoclonal
posee una mayor masa molar; lo cual pudiera estar ocasionado por el empleo de
las membranas de fibra hueca, ya que dichas fibras tienen cierta holgura y se
reduce el ensuciamiento del filtro.(14) Mientras que, Bolton y
colaboradores, reportan para los filtros Virosart
CPV, una capacidad másica de procesamiento de 26.400 g/m2 para
un anticuerpo monoclonal de 0,15 kg/mol,(13) siendo este valor
superior a los alcanzados en la proteína RBD (dímero y mezcla) y en los
anticuerpos monoclonales Nimotuzumab(9) y Racotumomab,(10) lo cual es de esperar, pues los
últimos mencionados poseen una masa molar mil veces superior a dicha proteína. Determinación
del costo de producción En las corridas productivas analizadas se
procesó una masa promedio de dímero y mezcla de 12,52 g y 31,77 g,
respectivamente. Los filtros empleados en el proceso pueden procesar 13,4 veces
la masa de la especie dimérica obtenida a escala
industrial, mientras que en la mezcla es de 27,74 veces. Los filtros Virosart CPV tienen un costo de 2.722,34 CUP.
Debido al flujo de proceso solo se pueden unir ocho lotes, por lo que se pueden
ahorrar en el proceso 19.056 CUP aproximadamente, tanto en el dímero (54,85 %) como
en la mezcla (25%), para un ahorro total de 38.112 CUP. Conclusiones La capacidad de procesamiento de los filtros Virosart
CPV para la proteína recombinante RBD, del
coronavirus tipo 2 del síndrome respiratorio agudo severo, la cual posee una cola de histidina, es de 239,74 g/m2 (71,67% de
saturación) para la especie dimérica y de 1.259 g/m2
(67,82% de saturación) para la mezcla. El incremento de la capacidad másica a
procesar en los filtros reduce el costo de producción de la etapa de nanofiltración
en 38.112 CUP, lo cual representa una disminución del 54,85% del costo de
nanofiltración del dímero y un 25% de la mezcla. Referencias 1. The International Council for Harmonisation of
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de resultados y revisión. Martha R. Castro-Figueroa: experimentación, procesamiento y análisis de
resultados. Lourdes M. Zumalacárregui-de Cárdenas: conceptualización, análisis de
resultados y revisión. Todos los autores
revisaron y aprobaron la versión final de este manuscrito. * Ingeniera Química, Especialista III en
Investigación, Innovación y Desarrollo. Centro de Inmunología Molecular, La Habana,
Cuba. Universidad Tecnológica de La Habana ¨José Antonio Echeverría¨, La
Habana, Cuba.
