Artículo Original
Estandarización
del procedimiento de Ellman por retroceso para la
cuantificación de grupos maleimidos en la anatoxina
tetánica funcionalizada, para su uso como proteína
portadora
Standardization
of the Ellman method by retrogression for the quantification of maleimide
groups in functionalized tetanus toxoid, for use as a carrier protein
Felix Cardoso-San Jorge1* ORCID: https://orcid.org/0000-0003-2540-7934
Bárbara Baró-Vicet1 ORCID:
https://orcid.org/0000-0001-5017-6571
Claudia C. Rodríguez-Elejalde1 ORCID: https://orcid.org/0009-0001-4885-7551
Lauren M.
Quintero-Moreno1 ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0936-3823
Jean P. Soubal-Mora1 ORCID: https:// orcid.org/0000-0002-9097-302X
Darielys
Santana-Mederos1 ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5333-554X
Sonsire
Fernández-Castillo1 ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5329-5971
Jessy Pedroso-Fernández1** ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5591-4972
Instituto Finlay
de Vacunas, La Habana, Cuba.
Autor para correspondencia: fcardoso@finlay.edu.cu; jpedroso@finlay.edu.cu
RESUMEN
Las vacunas conjugadas han demostrado ser la
plataforma más efectiva y eficiente para prevenir las infecciones provocadas
por bacterias encapsuladas (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influezae tipo b, entre otras) y, más recientemente,
contra el coronavirus de tipo 2 causante del
síndrome respiratorio agudo severo. Dentro de los métodos utilizados para obtener las
vacunas conjugadas se encuentran los basados en la reacción de Michael, donde
una de las macromoléculas que participa en la reacción se funcionaliza
con grupos maleimidos, siendo esta metodología la
utilizada para obtener los lotes experimentales y productivos de la vacuna
SOBERANA®02, por lo que para el buen desempeño tecnológico es
necesario conocer el nivel de funcionalización de la proteína portadora con
maleimido. El objetivo de este trabajo fue desarrollar y estandarizar un
procedimiento analítico para la cuantificación de los grupos maleimidos que funcionalizan las
proteínas portadoras, basado en el método de Ellman
por retroceso, para ser utilizado en los controles de proceso de la vacuna
SOBERANA®02. Se evaluaron los principales parámetros de desempeño
recomendados por la entidad regulatoria: linealidad en el intervalo de trabajo
de 0,25 - 4 µmol/L de grupos sulfhídricos, especificidad, precisión y
exactitud. Los procedimientos estadísticos basados en análisis descriptivos e
inferenciales utilizados permitieron determinar que el procedimiento es
específico para grupos maleimidos, lineal (r2>
0,98; CVf < 5 %,
desviación estándar relativa
(Sbrel) < 2 %, e intercepto no significativo), exacto (porcentaje de
recuperación sin diferencia significativas con el 100 %) y preciso en
condiciones de repetibilidad y precisión intermedia.
Palabras clave: proteínas portadoras; vacunas conjugadas;
estandarización; espectrofotometría; reactivo de Ellman;
maleimidas.
ABSTRACT
Conjugate vaccines have proven to be the most effective and efficient
platform for preventing infections caused by encapsulated bacteria (Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae type b, among
others) and, more recently, against severe acute respiratory syndrome
coronavirus type 2. Among the methods used to obtain conjugate vaccines are
those based on the Michael reaction, where one of the macromolecules
participating in the reaction is functionalized with maleimide groups; this
methodology has been used to obtain the experimental and production batches of
the SOBERANA®02 vaccine. Therefore, for proper technological
performance, it is necessary to know the level of maleimide functionalization
of the carrier protein. The objective of the present work was to develop and
standardize an analytical procedure for the quantification of the maleimide
groups that functionalize the carrier proteins, based on the Ellman method by
retrogression, to be used in process controls of the SOBERANA®02
vaccine. The main performance parameters recommended by the regulatory entity
were evaluated: linearity in the working range of 0.25 - 4 µmol/L of sulfhydric groups, specificity, precision and accuracy. The
statistical procedures based on descriptive and inferential analysis used allowed
to determine that the procedure is specific for maleimide groups, linear (r2 >
0.98; CVf < 5%, relative standard deviation (Sbrel) < 2%, and intercept not significant), exact
(percentage recovery with no significant difference with 100%) and precise under
conditions of intermediate repeatability and precision.
Keywords: carrier proteins; conjugate vaccines; standardization;
spectrophotometry; Ellman reactive; maleimides.
Recibido: 26 de diciembre de 2024
Aceptado: 21 de julio de 2025
Introducción
Los casos de COVID-19 provocados por la infección del coronavirus de tipo 2 causante del síndrome
respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2, por sus siglas en inglés), se incrementaron
bruscamente desde que se identificó el primer paciente reportado en Wuhan,
China. Según datos oficiales, en los años 2020 y 2021 se confirmaron más de 695
millones de casos de personas infectadas y alrededor de 7 millones de muertes
asociadas a la enfermedad en todo el mundo.(1) De ellos, en Cuba hubo más de 1.115.000 casos de personas contagiadas y
8.530 muertes asociadas a la enfermedad, según datos del Ministerio de Salud
Pública (MINSAP).(2)
Para responder con rapidez a este problema epidemiológico, se hizo
necesario la obtención de candidatos vacunales específicos contra el
SARS-CoV-2. La investigación-desarrollo, se basó fundamentalmente en el uso de
plataformas tecnológicas disponibles por los fabricantes de vacunas para otros
virus y bacterias.(3) En el Instituto Finlay de Vacunas (IFV) se
obtuvo la vacuna de subunidades SOBERANA®02, que se basa en la
conjugación del sitio de unión al receptor (RBD, por sus siglas en inglés) de
la proteína S del virus SARS-CoV-2 con la anatoxina tetánica (TT). Para esto,
se utiliza el grupo sulfihidrilo libre (-SH) de la
cisteína 539 en la construcción del RBD empleado como antígeno, mientras que la
TT se funcionaliza con grupos maleimidos.(4) Como parte de su desarrollo tecnológico y como control de proceso, es
necesario conocer el nivel de activación de la TT funcionalizada,
por lo que es necesario implementar un procedimiento capaz de cuantificar este
grupo funcional.
El uso de la química del grupo maleimido se ha extendido(5,6,7,8) debido a la versatilidad, la rapidez y pureza de sus reacciones, siendo
necesario desarrollar procedimientos analíticos capaces de cuantificarlo y con
ello determinar la activación de las macromoléculas. En nuestro conocimiento no
existe un reactivo con características tales que permita un desarrollo
colorimétrico directo a partir de la reacción con este grupo; de ahí que la
estrategia ha sido hacer reaccionar de manera cuantitativa los maleimidos, con un exceso de un grupo complementario que sí
se pueda cuantificar.(9,10) Los grupos maleimidos activantes de la
macromolécula se hacen reaccionar con moléculas que presentan grupos -SH libres en su estructura, entre los más utilizados
están los presentes en la cisteína y el mercaptoetanol,
mediante una reacción de adición de Michael. Los grupos -SH remanentes de la
reacción se cuantifican por un procedimiento basado en el método de Ellman;(9,10) los reactivos más utilizados en estos procedimientos son el reactivo de
Ellman (ácido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzoico)(9) y el 4,4 ditio-piridina (DTDP).(11)
Los procedimientos analíticos utilizados en la
investigación-desarrollo-producción de un producto, para la seguridad de los
resultados que aportan, se deben estandarizar y validar.(12) Las normas de Buenas Prácticas de Fabricación, la
Convención de Farmacopeas y la Conferencia Internacional de Armonización
plantean que la estandarización y validación deben aplicarse tanto a los
procesos de fabricación como a los métodos de análisis y control.(13,14) Como objetivo del trabajo se propuso implementar y estandarizar un
procedimiento analítico capaz de determinar de forma precisa y exacta los
grupos maleimidos activantes en la TT para su uso
como proteína portadora.
Materiales
y Métodos
Muestras y disoluciones
empleadas
Las proteínas TT y anatoxina diftérica (TD) nativas disueltas en agua
destilada y modificadas con grupos maleimidos fueron
suministradas por el Grupo de Glicoconjugación de la
Dirección de Investigaciones del IFV, La Habana, Cuba. El polirribosil-ribitol
fosfato procesado (PRP Procesado) fue proporcionado por el Grupo de Producción
de Síntesis de la Dirección de Producción del IFV. La albúmina sérica bovina
(BSA, por sus siglas en inglés), fracción V, 98 % de pureza y el N-etilmaleimido para síntesis, fueron suministrados por Merck
(Alemania) al igual que el resto de los reactivos utilizados en el
procedimiento.
La disolución estándar de glutatión reducido (4 µmol/L) se preparó disolviendo el glutatión reducido (C10H17N3O6S,
307,32 g/mol, 98 %) en agua destilada.
La disolución de reactivo de Ellman, ácido
5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzoico), 4 mg/mL se utilizó como reactivo
desarrollador de color; se preparó disolviendo el reactivo de Ellman (C₁₄H₈N₂O₈S₂, 396,35 g/mol, 98 %) en agua destilada
y se conservó a una temperatura de 2-8 °C.
La disolución tampón de fosfato 1N, pH 8,0, se utilizó como disolución tampón de pH y diluyente del complejo
coloreado; se preparó disolviendo el hidrogenofosfato de di-sodio (Na2HPO4, 141,96 g/mol, pa,
99 %) en agua destilada y se conservó a temperatura ambiente.
Reacción de las macromoléculas modificadas con
grupos maleimidos con la disolución de glutatión
Se trasvasaron, por triplicado, 25 µL de muestra de macromolécula
modificada a la dilución deseada con igual volumen de glutatión 4 µmol/mL y se
dejó reposar por 30 min, a temperatura ambiente.
Procedimiento basado en el método de Ellman(9,10,13)
A un volumen de 50 µL de muestra previamente
tratada con disolución de glutatión 4 µmol/mL, al
blanco, patrones y al control positivo, trasvasados a tubos de ensayo, se
les añadió 50 µL de disolución de reactivo Ellman 4 mg/mL y
se agitó ligeramente cada tubo en agitador vortex (MS, IKA, Alemania). Posteriormente se adicionó 2,5 mL
de la disolución de hidrogenofosfato de di-sodio 1N, pH 8,0, se homogenizó en vórtex durante unos
segundos y se mantuvo en reposo por 15 min a temperatura ambiente. A las
mezclas se le midió las absorbancias a una longitud de onda de 412 nm en un
espectrofotómetro Ultrospec 9000 PC (Biochrom, UK).
Para el
procesamiento de los resultados, se empleó una hoja de cálculo en Microsoft
Excel, versión 2016. Se determinó el valor de concentración de cada punto de la
curva de calibración a partir de las absorbancias y se obtuvo un ajuste lineal
a través de la ecuación: y = mx + b. La concentración de las muestras se
calculó a partir de los valores de absorbancias mediante el método de mínimos
cuadrados. Se promediaron los valores de las concentraciones (mg/mL) obtenidas,
cuyas absorbancias estuvieran dentro del rango de la curva de calibración y que
su coeficiente de variación (CV) intraensayo fuera inferior al 5 %.(13) Se utilizó el programa
STATGRAPHICS 5 plus versión 5.1, para realizar los
cálculos y procesamientos estadísticos.
Parámetros de estandarización
Se evaluaron la especificidad, linealidad,
exactitud y precisión(15) del procedimiento de Ellman
por retroceso descrito previamente.
Especificidad
Se realizó la evaluación
de la especificidad(13,15) mediante
el procedimiento Ellman por retroceso descrito anteriormente, utilizando muestras
de proteínas portadoras TT y TD, así como BSA, modificadas con grupos maleimidos y disueltas en agua, un oligosacárido de PRP
modificado con este grupo funcional obtenido por síntesis química, tampón HEPES
500 µmol/L con el que se purifican las proteínas modificadas y N-etil
maleimido.
Linealidad
Para ello se
utilizó la curva de calibración en el intervalo de 0,25 - 4 µmol/mL de
grupos -SH, evaluando cada una de las concentraciones por cuadruplicado. Mediante
los programas Microsoft Excel versión 2016 y STATGRAPHICS 5 plus, se calculó
la ecuación de la recta, su coeficiente de correlación (r), el coeficiente de
variación del factor respuesta (CVf), la desviación estándar relativa de la
pendiente (Sbrel); también se realizó la prueba de proporcionalidad
para el intercepto, evaluándose si existe diferencia estadísticamente
significativa entre el intercepto obtenido experimentalmente y el valor cero.(15,16)
Exactitud
Se realizó mediante
un experimento de añadido-recobrado. A una muestra de TT-maleimido, se le
añadieron cantidades de N-etil maleimido, se calculó el recobrado y el
porcentaje de recuperación se comparó mediante una prueba t de Student con el 100 % de recuperación para un nivel de
confianza de 95 %, utilizando el programa STATGRAPHICS 5 plus.(15)
Precisión
Se evaluó en condiciones
de repetibilidad (estudio intraensayo) y precisión
intermedia (estudio interensayo).
Para el estudio de
repetibilidad, se realizó la determinación de grupos maleimidos
activantes en una muestra de TT activada (por sextuplicado) en estudio intraensayo, de muestras de anatoxina tetánica modificada
con grupos maleimidos, por un mismo analista, en las
mismas condiciones de día, laboratorio y equipamiento.
Los resultados
obtenidos se procesaron estadísticamente con la utilización de las herramientas
de Microsoft Excel versión 2016. Se calculó el CV expresado en porcentaje (CV
%) y se comparó con el valor del coeficiente aceptado para metodologías basadas
en métodos espectrofotométricos, que debe ser inferior al 3 %.(15,17)
Para el estudio de
precisión en condiciones de precisión intermedia, se cuantificaron muestras de
anatoxina tetánica modificada con grupos maleimidos,
por tres analistas en 3 días diferentes, en iguales condiciones de laboratorio
y equipamiento.(15,18) Para demostrar su
cumplimiento se evaluó que no existieran diferencias estadísticamente
significativas entre los resultados obtenidos por los tres analistas durante
los 3 días mediante una comparación de muestras pareadas, utilizando el procedimiento de mínima diferencia significativa de Fisher
(LSD), para un 95 % de
confianza, auxiliándonos del Microsoft Excel 2016 y STATGRAPHICS 5 plus versión
5.1.
Resultados
y Discusión
La estandarización y validación de los métodos
analíticos desempeña un papel determinante, pues de ellos depende la
comprobación confiable y reproducible de los índices de calidad de los
resultados obtenidos para el desarrollo de los diferentes candidatos vacunales
que se investigan y desarrollan.(13,14,15,19,20)
El método analítico establecido se clasificó como
ensayo cuantitativo(15,16) por
tratarse de un ensayo destinado a cuantificar el contenido de un grupo
funcional modificante de la molécula TT. El diseño de la estandarización que se
empleó se realizó teniendo en cuenta la clasificación reguladora por lo que se
evaluaron los parámetros siguientes: especificidad, linealidad, precisión
(precisión intraensayo e interensayos)
y exactitud.(15)
Se estudió la especificidad del método mediante la
evaluación de muestras de proteínas que se utilizan frecuentemente como
portadoras en la obtención de conjugados (tanto nativas disueltas en agua
destilada, como modificadas con grupos maleimidos),
moléculas con este grupo funcional y disolución tampón donde están disueltas
las proteínas modificadas. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1.
Para las muestras de proteínas funcionalizadas, N.-etilmaleimido y el PRP Procesado, que son las moléculas
utilizadas en el estudio que presentan grupos maleimidos
que reaccionan con los grupos sulfhídrilos (-SH)
presentes en la molécula de glutatión, los valores de concentración de grupos
-SH fueron inferiores a la muestra referencia de glutatión; mientras que para
las muestras estudiadas que no presentan el grupo maleimido en su estructura se
observa que sus concentraciones de grupos -SH si son similares a la muestra de
referencia de glutatión, aproximadamente de 4 µmol/mL, lo que demuestra que el procedimiento estudiado es
específico para cuantificar grupos maleimidos, no
existiendo evidencias experimentales de interferencias de las proteínas
utilizadas como portadoras, así como el tampón donde se disuelven las proteínas
activadas con este grupo funcional.
Tabla 1. Procesamiento analítico del estudio de
especificidad.
El estudio de la linealidad de la curva de
calibración en el rango de trabajo resultó ser satisfactorio (Tabla 2). Se
observó que los resultados de los análisis estadísticos obtenidos en todos los
casos cumplieron con el criterio de aceptación propuestos para cada prueba,
pues la ecuación de la curva de calibración obtenida
fue: y = 0,254 x + 0,0062 con un coeficiente de correlación (r) igual a 0,9994,
valor superior al establecido (0,99).(15,16) El
resto de los parámetros estudiados también cumplieron con los criterios de
aceptación;(15,16) el CVf
(absorbancia/concentración) no fue superior al 5 %, obteniéndose un CV
experimental de 3,86 %. La Sbrel calculada tiene un valor de 0,73 %, muy
inferior al 2 %, lo que demuestra poca dispersión de los valores de la
pendiente. Al aplicar la prueba de proporcionalidad del intercepto, el
intervalo de confianza resultó ser [-0,0023; 0,0148]. Por tanto, se puede decir
que el método desarrollado es lineal en el rango de concentraciones estudiadas.
Adicionalmente se demostró el cumplimiento de la ley de Beer-Lambert.
Tabla 2. Comparación de los resultados experimentales y los criterios de
aceptación para el estudio de la linealidad.
|
Parámetros |
Teórico (15,16) |
Experimental |
|
Ecuación de la recta |
y= mx + a |
y= 0,254x + 0,0062 |
|
r |
≥ 0,99 |
0,9994 |
|
CVf |
≤ 5 % |
3,89 |
|
Sbrel |
≤ 2 % |
0,73 |
|
Intercepto(a) |
0 incluido en IC a |
[-0,0023; 0,0148] |
r: coeficiente de correlación. CVf: coeficiente de
variación del factor respuesta. Sbrel: desviación estándar relativa de la pendiente.
IC a: intervalo de confianza del intercepto.
Los resultados del estudio de exactitud del
procedimiento analítico se muestran en la Tabla 3. Se compara los porcentajes
de recobrado promedio obtenidos en un experimento de añadido-recobrado,
con el 100 por ciento de recobrado para un nivel de confianza del 95 %. Además,
se reportan los resultados del cálculo de los porcentajes de recobrado de cada
adición y el recobrado global de las tres adiciones. Los porcentajes de
recobrado calculados experimentalmente se compararon mediante el estadígrafo t
de Student, utilizando el programa estadístico
STATGRAPHICS 5 Plus versión 5.1.
Los resultados del procesamiento estadístico para la comparación de la media de los porcentajes de recobros, de las cantidades de N-etil maleimido (99,69 %) obtenidos experimentalmente, con el 100 % de recuperación utilizando la prueba t de Student, se muestran en la Tabla 3. Los valores del estadígrafo p obtenido experimental fue de 0,698908, valor superior a 0,05, valor del alfa (a), por lo que la probabilidad estadística de que se cumpla la hipótesis alternativa es baja para un significado estadístico del 95 %; por lo que se cumple la hipótesis nula, por tanto no existe diferencia estadísticamente significativa entre los porcentajes de recobro calculados y el 100 %, por lo que se puede plantear que en las condiciones que estudiamos el procedimiento es exacto.
Tabla 3.
Estudio de la exactitud del procedimiento mediante un experimento de añadido
recobrado.
|
µmoles muestra |
µmoles* añadidos |
µmoles* recobrados calculados |
% recobrado |
% recobro global |
|
|
|
0,249 |
98,317 |
|
|
|
0,169 |
0,236 |
90,606 |
|
|
|
|
0,265 |
107,956 |
|
|
|
|
media |
98,96 |
|
|
|
|
0,425 |
101,209 |
|
|
0,082 |
0,338 |
0,444 |
106,992 |
99,69 |
|
|
|
0,395 |
92,534 |
|
|
|
|
media |
100,25 |
|
|
|
|
0,744 |
97,835 |
|
|
|
0,676 |
0,741 |
97,353 |
|
|
|
|
0,760 |
100,245 |
|
|
|
|
media |
98,48 |
|
*µmoles de grupos maleimidos.
Los resultados de la evaluación de la precisión en condiciones de
(repetibilidad y precisión intermedia) cumplen los criterios de aceptación
establecidos;(15,17,18,21) los CV son inferiores al 3 % para la repetibilidad (Tabla 4) y la no
diferencia estadísticamente significativa de los resultados de concentración de
grupos maleimido determinados por tres analistas durante 3 días, para la
precisión intermedia, utilizando el procedimiento de mínima diferencia
significativa de Fisher (LSD) (Fig. 1), corroboran este resultado.
Tabla 4.
Estudio de precisión en condiciones de repetibilidad.
|
Réplicas |
C1 (µmol/mL) |
C2 (µmol/mL) |
C3 (µmol/mL) |
CMedia (µmol/mL) |
SD |
CV (%) |
|
1 |
2,006 |
2,170 |
2,186 |
|
|
|
|
2 |
2,104 |
2,137 |
2,137 |
|
|
|
|
3 |
2,104 |
2,153 |
2,137 |
2,125 |
0,059 |
2,78 |
|
4 |
2,100 |
2,198 |
2,214 |
|
|
|
|
5 |
2,165 |
2,149 |
2,133 |
|
|
|
|
6 |
2,100 |
2,051 |
2,002 |
|
|
|
C:1…n: concentración de grupos maleimidos. Cm:
concentración de grupos maleimidos media (µmol/mL). SD: desviación estándar. CV:
coeficiente de variación.
Fig. 1. Resultado del estudio de precisión intermedia comparando los resultados
obtenidos por tres analistas en 3 días consecutivos, mediante el intervalo LSD
de las medias de las concentraciones de grupos maleimidos,
para un nivel de confianza estadística del 95%.
Conclusiones
La estandarización del procedimiento analítico de cuantificación de
grupos maleimidos, basado en el método de Ellman por
retroceso, demostró que este método puede utilizarse en el proceso de
activación de la proteína TT, de la vacuna conjugada SOBERANA®02, al
mantener un control analítico adecuado y corroborar que es especifico, lineal
en el intervalo de concentraciones estudiadas, preciso en condiciones de
repetibilidad y precisión intermedia y exacto.
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Conflicto de Intereses
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Roles de autoría
Felix Cardoso-San Jorge: participó en la conceptualización, curación de
datos, análisis formal, Investigación, metodología, visualización, redacción
(borrador original) y revisión/edición.
Bárbara Baró-Vicet: participó en la
conceptualización, curación de datos, investigación, metodología y
visualización.
Claudia C. Rodríguez-Elejalde participó en la investigación, visualización.
Lauren M. Quintero-Moreno: participó en la investigación, visualización.
Jean P. Soubal-Mora:
participó en la investigación, visualización
Darielys Santana-Mederos: participó en la investigación, visualización.
Sonsire Fernández-Castillo: participó en la investigación, visualización.
Jessy Pedroso-Fernández: participó en el análisis formal, metodología,
redacción (borrador original), revisión y visualización.
Todos los autores revisaron y aprobaron la versión final de este
manuscrito.
*Máster en Química, Investigador Agregado. Instituto Finlay de Vacunas. La Habana, Cuba.
**Máster en Química, Investigador
Auxiliar. Instituto Finlay de Vacunas. La Habana, Cuba.