Artículo Original
Validación del método
colorimétrico de bifenilo para la determinación del contenido de carbohidratos
en el polisacárido capsular de Streptococcus
pneumoniae serotipo 5
Validation
of the biphenyl colorimetric method for the determination of carbohydrate
content in capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae serotype
5
Jennifer Caridad Abreu-Vázquez* ORCID: https://orcid.org/0009-0004-1374-0451
Janet Zita Pérez-Herrera ORCID: https://orcid.org/0009-0007-1254-8478
Aida Yaima Merchán-Miliá ORCID:
https://orcid.org/0009-0000-1065-9683
Instituto
Finlay de Vacunas, La Habana, Cuba.
Autor para correspondencia: jabreu@finlay.edu.cu
RESUMEN
Streptococcus pneumoniae se encuentra
entre los mayores patógenos causantes de infecciones invasoras y no invasoras
en los dos extremos de la vida: niños
menores de 5 años y personas mayores de 65 años de edad. El Instituto Finlay de Vacunas inició el "Proyecto Neumococo",
consistente en la concepción y desarrollo de la vacuna Quimi-Vio® (vacuna
antineumocócica) cuya composición incluye 2 µg de polisacáridos de los
serotipos 1, 5, 14, 18C, 19F, 23F y 4 μg del 6B conjugados con toxoide
tetánico adsorbido sobre fosfato de aluminio. La validación de los métodos que
permitan identificar y cuantificar los principios activos (polisacáridos
capsulares en este caso) presentes en las formulaciones están dentro de los
requisitos obligatorios para la liberación final del producto. Durante el
proceso de control de calidad de estos polisacáridos, se evalúa el contenido o
concentración de carbohidratos, que en el caso de los serotipos 1 y 5 se
realiza mediante el método colorimétrico de bifenilo (m-hidroxibifenil). El presente trabajo tuvo como
objetivo la validación del procedimiento analítico basado en el método de
bifenilo para cuantificar carbohidratos en polisacáridos capsulares purificados
de Streptococcus pneumoniae
del serotipo 5, debido a la importancia de contar con un método de
cuantificación de carbohidratos validado que permita ser aplicado en el control
de calidad de estos ingredientes farmacéuticos activos. Se empleó una solución
estándar de ácido galacturónico a 1 mg/mL preparada a
partir de un Material de Referencia de Trabajo, ácido galacturónico lote AG (1)/18 para la preparación de la curva de calibración. Se
realizó una evaluación de los parámetros de validación: linealidad, exactitud,
precisión y especificidad, según exigencias actuales. El método de bifenilo fue
específico, lineal, exacto y preciso en el rango de 0,005 - 0,10 mg/mL puesto que se cumplieron satisfactoriamente los
criterios de aceptación establecidos para cada uno de ellos. El método
colorimétrico de bifenilo o m-hidroxibifenilo resultó
válido para el control de calidad de las muestras de polisacárido capsular
purificado de Streptococcus pneumoniae evaluado, brindando resultados confiables.
Palabras clave: estudio de validación;
colorimetría; Streptococcus pneumoniae.
ABSTRACT
Streptococcus pneumoniae is among the major
pathogens that cause invasive and non-invasive infections at both ends of life:
in children under 5 years of age and in people over 65 years of age. The Finlay
Vaccine Institute initiated the "Pneumococcus Project", consisting of
the conception and development of the Quimi-Vio®
vaccine (pneumococcal vaccine) whose composition includes 2 µg of
polysaccharides of serotypes 1, 5, 14, 18C, 19F, 23F and 4 μg of 6B conjugated with
tetanus toxoid adsorbed on aluminum phosphate. The validation of the methods
that allow the identification and quantification of the active ingredients
(capsular polysaccharides in this case) present in the formulations are within
the mandatory requirements for the final release of the product. During the
quality control process of these polysaccharides, the content or concentration
of carbohydrates is evaluated, which in the case of serotypes 1 and 5 is
carried out using the biphenyl assay (m-hydroxybiphenyl
colorimetric method). The objective of this work was to validate the biphenyl
method to quantify carbohydrates in purified capsular polysaccharides from Streptococcus
pneumoniae serotype 5, due to the importance of having a validated
carbohydrate quantification method that allows it to be applied in quality
control of pneumococcus active pharmaceutical ingredients. A standard solution
of galacturonic acid at 1 mg/mL prepared from a Working Reference Material,
galacturonic acid batch AG (1)/18, was used for the preparation of the
calibration curve. An evaluation of the validation parameters was carried out:
linearity, accuracy, precision and specificity, according to current
requirements. The biphenyl method was specific, linear, exact and precise in
the range of 0.005 - 0.10 mg/mL since the acceptance criteria established for
each of them were satisfactorily met. The biphenyl or m-hydroxybiphenyl
colorimetric method was valid for quality control of the purified capsular
polysaccharide samples of Streptococcus pneumoniae evaluated, giving
reliable results.
Keywords: validation; colorimetry; Streptococcus
pneumoniae.
Recibido: 15 de mayo de 2024
Aceptado: 5 de mayo de 2025
Introducción
Streptococcus pneumoniae se encuentra entre los
mayores patógenos causantes de infecciones invasoras y no invasoras en los dos
extremos de la vida: en niños menores de 5 años y en personas mayores de 65
años de edad. Las principales manifestaciones asociadas a infecciones neumocócicas
son: neumonía, bacteriemia febril, septicemia, otitis media y meningitis.(1)
Uno de los factores de riesgo de la infección neumocócica en niños es la
falta de inmunización. La Organización Mundial de la Salud recomienda la
inclusión de vacunas antineumocócicas conjugadas en los programas de
inmunización infantil, dirigidas a los serotipos más prevalentes a nivel
mundial. Estas vacunas garantizan la protección contra dicho patógeno causante
de las enfermedades antes mencionadas.(2)
La primera vacuna neumocócica fue elaborada en 1911 a partir de células
enteras. Posteriormente, otros investigadores llevaron a cabo ensayos clínicos
para evaluar la eficacia y seguridad de vacunas basadas en polisacáridos
capsulares de diferente número de serotipos (6, 14 y 23 serotipos).(3)
Se ha observado que las vacunas que contienen sólo polisacáridos son
poco inmunogénicas, que la inmunidad decrece con el tiempo y que proporcionan
poca memoria inmunológica tras dosis repetidas debido a que los polisacáridos
inducen una respuesta timo-independiente. Para mejorar esto se desarrollaron
las vacunas conjugadas en las cuales se une el polisacárido a una proteína
transportadora que permite estimular los linfocitos T y, por tanto, mejorar la
inmunidad logrando que sea del tipo timo-dependiente. Esta conjugación se ha
utilizado en diferentes vacunas como son las vacunas frente a Streptococcus pneumoniae
(VCP-7v) y frente a Neisseria meningitidis C, entre otras, siendo las proteínas
utilizadas para unirse al polisacárido el toxoide tetánico o el complejo
proteico de la membrana externa de Neisseria
meningitidis.(4)
El Instituto Finlay de Vacunas (IFV),
desarrolla la vacuna conjugada antineumocócica polisacarídica
Quimi-Vio® cuya composición incluye polisacáridos conjugados con toxoide
tetánico adsorbido sobre fosfato de aluminio como adyuvante. Los métodos que
permiten identificar y cuantificar los principios activos (polisacáridos
capsulares) presentes en esta formulación, están dentro de los requisitos
obligatorios para la liberación final del producto. La autoridad regulatoria
cubana (CEDMED) recomienda para estos fármacos, que la prueba de identidad se
realice por técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) o inmunoquímicas
como western blot y dot blot.(5,6) Para la cuantificación de su
ingrediente farmacéutico activo (IFA), la Farmacopea Europea, en 2011,
recomendó el empleo del método colorimétrico del carbazol
para la determinación del contenido de ácido urónico
en los polisacáridos capsulares purificados de Streptococcus
pneumoniae.(7) Este método tiene como
desventajas el consumo de una mayor cantidad de muestra y de tiempo de
procesamiento. Sin embargo, el método colorimétrico m-hidroxibifenil
desarrollado por Blumenkrantz y Asboe-Hansen,
en el año 1973,(8) permite una
disminución en la cantidad de muestra a emplear, y su procedimiento es mucho
más rápido. El método del m-hidroxibifenil
previamente validado por Pérez-Calixto y colaboradores,(9)
en la cuantificación de ácido urónico en
muestras de polisacárido purificado de Streptococcus
pneumoniae en el IFV, brinda resultados
comparables al de carbazol, reportado en la
Farmacopea Europea,(7) resultado de gran importancia porque
posibilita su aplicación.
En el IFV, durante el control de calidad de estas IFAs,
se realiza la determinación de la identidad mediante el método inmunoquímico de
dot-blot y la cuantificación
del contenido de carbohidratos mediante el método colorimétrico de bifenilo
(m-hidroxibifenil) desarrollado por Blumenkrantz y Asboe-Hansen(8)
para los serotipos 1 y 5, basado en la hidrólisis del polisacárido capsular de
neumococo de ambos serotipos por la acción del tetraborato
de sodio en H2SO4 concentrado y calor, con la posterior
reacción con m-hifroxibifenilo formando un compuesto
de color rosado soluble en agua que exhibe su máxima absorbancia a 520 nm.
Las Buenas Prácticas de Producción constituyen un conjunto de
regulaciones y requisitos que aseguran la idoneidad de los métodos, las instalaciones
y los controles para la fabricación de medicamentos. De estas se deriva, que
todos los procedimientos analíticos empleados para análisis deben ser adecuados
para el uso al que están destinados. Esto se demuestra por validación, la cual
consiste en el establecimiento de pruebas documentales que aportan un alto
grado de seguridad, de que un proceso planificado se efectuará uniformemente en
conformidad con los resultados previstos especificados.(10) Por
tanto, el proceso de validación de los métodos analíticos es imprescindible
para asegurar la confiabilidad de los resultados y cumplir con los
requerimientos de las Buenas Prácticas de Producción para la Fabricación de
Productos Farmacéuticos y en especial de las vacunas para uso humano. El objetivo
del presente trabajo fue la validación del método colorimétrico de bifenilo
para la cuantificación de carbohidratos en polisacáridos capsulares purificados
de Streptococcus pneumoniae
del serotipo 5, el cual constituye el método establecido para la cuantificación
de carbohidratos en dichas IFAs en el IFV.
Materiales
y Métodos
Muestras
Para realizar la validación del método analítico fueron utilizados tres
lotes de polisacárido capsular de Streptococcus
pneumoniae serotipo 5, purificados en la Planta
de Producción de IFAs del IFV. Esta IFA presentó
características organolépticas adecuadas (granulado blanco o cremoso y que
después de resuspendido forma una disolución
transparente o con ligera turbidez) según su especificación de calidad (ESPE
02-143) en el IFV.
Preparación de las muestras
El polisacárido capsular purificado seco serotipo 5 fue previamente
analizado y determinado su porciento de humedad y peso seco en el laboratorio
de Materias Primas de la Dirección de Calidad del IFV, se disolvió en agua
purificada, hasta una concentración de 5 mg/mL.
Posteriormente se le realizó una dilución 1/25, y se tomaron 200 µL por
triplicado para realizar el ensayo.
Preparación de la curva de calibración
Se utilizó 1 bulbo de material de referencia de ácido galacturónico lote
AG (1)/18, elaborado y caracterizado previamente por
el laboratorio de Materiales de Referencia de la Dirección de Calidad del IFV.
El material de referencia se resuspendió en
9,6 mL de agua purificada, para obtener la solución
estándar (SE) de ácido galacturónico a 1 mg/mL. Se
adicionaron alícuotas de 5, 10, 20, 40, 80 y 100 μL
de la SE a viales, y se completó a 1 mL con agua
purificada. Se tomaron 200 μL por triplicado de
cada una de las soluciones preparadas anteriormente y se adicionaron a tubos de
ensayo, para obtener 0,005; 0,010; 0,020; 0,040; 0,080 y 0,100 mg/mL respectivamente de ácido galacturónico en cada punto de
la curva.
Método analítico
Los tubos de ensayo conteniendo 200 µL de la curva de calibración, el
blanco y las muestras, se introdujeron en un baño de agua helada. Se le
adicionó a cada tubo 1,2 mL de una solución al 0,48 %
de tetraborato de sodio decahidratado
(Merck, Alemania) (0,96 g) en H2SO4 concentrado (Merck,
Alemania) (95-98 %), se agitó vigorosamente, y se colocaron en un baño de agua
a 100 °C durante 5 min, luego se extrajeron y se dejaron enfriar en un baño de
agua helada. A continuación, se añadieron 20 μL
de la solución de bifenilo (m-hidroxibifenil)
(Sigma-Aldrich, Alemania) en NaOH (Panreac-Applichem,
Alemania) a todos los tubos excepto al blanco al que se le añadió 20 μL de una solución de NaOH 0,5 %. Se agitó hasta la
aparición de una coloración rosada y se dejó reposar 5 min, posteriormente se
leyó la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda 520 nm según
se describe en el PNO 12-577 de la Dirección de Calidad del IFV.
Validación del método analítico
El método de ensayo se clasifica dentro de la categoría de ensayos de
contenido/potencia (métodos analíticos para la cuantificación del fármaco o de
los principios activos, incluyendo los preservos).
Para su validación se evaluaron los parámetros de precisión (precisión
intermedia y repetibilidad), exactitud, linealidad y especificidad.(10,11)
Precisión
Repetibilidad
Se tomó una muestra homogénea de cada uno de los lotes de polisacárido
capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 5 en estudio. A seis réplicas de
cada lote, se les realizó la determinación del contenido de carbohidratos por
el método de bifenilo por un mismo analista, bajo las mismas condiciones de
operación, a un solo nivel de concentración de la muestra (100 %). Se determinó
el coeficiente de variación (CV) entre los valores de concentración de
carbohidrato obtenidos para cada una de las muestras ensayadas.(10,11)
Precisión Intermedia
Se realizó con tres réplicas de cada lote de serotipo 5, evaluadas por dos
analistas, con soluciones preparadas por cada uno en días diferentes. El ensayo
se realizó a un solo nivel de concentración (100 %). Se determinó el CV entre
los valores de concentración de carbohidrato para cada una de las muestras
ensayadas y se compararon los resultados obtenidos por ambos analistas mediante
una prueba de intervalo de confianza para dos varianzas utilizando el método de
Levene (p ≥ 0,05).(10,11)
Exactitud
Se realizó por triplicado a partir de tres muestras preparadas de forma independiente
de los lotes, cargadas con 1 mg de ácido galacturónico, a partir de la SE de
ácido galacturónico de referencia de concentración (1 mg/mL).(10,11) Se determinó el intervalo de
confianza de los valores de concentración hallados, así como el CV de los
porcentajes de recobrado obtenidos para cada una de las muestras estudiadas. Se
aplicó la prueba t Student para comparar el
recobrado medio y la concentración esperada, realizándose una prueba de
igualdad de varianza por el método de Bonferroni (p ≥ 0,05).
Linealidad
Se analizaron tres curvas de calibración preparadas en tres días
diferentes, se determinó el CV entre los valores de absorbancia de los puntos
de la curva, así como el coeficiente de determinación (R2) y el
coeficiente de correlación (R).(10,11)
Especificidad
Se utilizaron tres muestras
de polisacáridos capsulares de Streptococcus
pneumoniae serotipo 23F, el cual no presenta en
su estructura grupos funcionales detectables por este método. A tres réplicas
de estas muestras se les realizó la determinación de carbohidrato por el método
de bifenilo. En este parámetro se evaluó la capacidad del método para
identificar solo el analito de interés.(10)
Resultados
y Discusión
Precisión
Repetibilidad
Durante la evaluación de la repetibilidad (Tabla 1), en todos los casos
se obtuvo un CV menor del 3 % lo que cumple con el criterio de aceptación
establecido para métodos físico-químicos (5 %)(10,11),
demostrándose que la repetibilidad del método es buena bajo nuestras
condiciones de trabajo.
Tabla 1. Evaluación de la
repetibilidad.
|
Lote |
Media C (mg/mL) ± 2 DS |
CV % |
|
31 EPCSP5-201 |
2,656 ±
0,0045 |
2,75 |
|
31 EPCSP5-202 |
2,811 ±
0,0047 |
2,69 |
|
31 EPCSP5-203 |
2,844 ±
0,0051 |
2,74 |
C:
concentración. DS: desviación estándar. CV: coeficiente de variación.
Precisión intermedia
Para los lotes evaluados, los CV obtenidos en la precisión intermedia
entre los dos analistas cumplieron con el criterio de aceptación (< 5 %)(10,11) lo que sugiere que el método
analítico es preciso (Tabla 2), pues se obtuvieron resultados satisfactorios independientemente
del día en que se efectuó el ensayo. Además, al analizar los resultados
mediante la prueba de intervalo de confianza para dos varianzas utilizando el
método de Levene se obtuvieron valores de p> 0,05 para todos los lotes
evaluados, pudiendo inferir que no existen diferencias significativas entre los
resultados obtenidos por ambos analistas.
Tabla 2. Evaluación de la precisión
intermedia.
|
Lote |
Media C (mg/mL) ± 2 DS |
CV % |
p |
|
31 EPCSP5-201 |
2,469 ±
0,0071 |
3,5 |
0,939 |
|
31 EPCSP5-202 |
2,660 ± 0,0068 |
3,2 |
0,306 |
|
31 EPCSP5-203 |
2,601 ±
0,0134 |
4,5 |
0,931 |
C: concentración. DS: desviación estándar. CV: coeficiente de variación.
Exactitud
Este parámetro se analizó mediante el método de adición de patrón, en el
cual se tomaron alícuotas de las muestras de cada lote y se les añadió
cantidades conocidas (1 mg) de la SE de referencia para así obtener la muestra
cargada, dejando una alícuota de cada lote sin cargar (muestra sin cargar), a
partir de la cual se calculó la concentración (conc.)
teórica esperada mediante la fórmula:
Conc. teórica o esperada = conc. muestra sin cargar + 1 mg de ácido galacturónico
añadido
Dichas muestras se analizaron en paralelo.
Posteriormente se calculó el porciento de recobro (% R) mediante la
fórmula:
% R= (Conc. muestra cargada/Conc. muestra sin cargar) * 100
Al evaluar la recuperación mediante los % R, se obtuvieron resultados
dentro del rango establecido (97 - 103 %)(9,10) y el intervalo de
confianza estuvo entre 98,72 - 102,59. Los CV fueron inferiores al 5 %, cumpliendo
con el criterio de aceptación.(10) La prueba t Student, según el análisis de igualdad de varianza
del método de Bonferroni, indicó que no existían diferencias significativas
entre los resultados del recobrado y la concentración esperada para los tres
lotes evaluados (p > 0,05), resultados comparables con los obtenidos
previamente por Pérez Calixto y colaboradores.(9)
El cumplimiento de todos los criterios establecidos al procesar los
resultados de las muestras cargadas, demostró la correlación entre la
concentración teórica o esperada y la experimental. Esto indica que el método
es exacto, y permite obtener valores experimentales muy próximos al valor
verdadero (Tablas 3 y 4).
Tabla 3. Concentración de
carbohidrato en muestras sin cargar.
|
Lote |
Conc. (mg/mL)
media |
DS |
CV |
Conc. teórica (mg/mL) |
|
31-EPCSP5-201 |
2,47 |
0,0330 |
1,35 |
3,47 |
|
31-EPCSP5-202 |
2,70 |
0,0403 |
1,49 |
3,70 |
|
31-EPCSP5-203 |
2,57 |
0,0215 |
0,83 |
3,57 |
Conc: concentración. DS: desviación
estándar. CV: coeficiente de variación.
Tabla 4. Evaluación de la
exactitud. Concentración de carbohidrato en muestras cargadas. Determinación de
% R.
|
Lote |
Conc. (mg/mL)
media |
% R media |
DS |
CV |
Intervalo de confianza |
p |
|
31-EPCSP5-201 |
3,55 |
102,4 |
1,113 |
1,09 |
98,72-102,59 |
0,778 |
|
31-EPCSP5-202 |
3,73 |
100,8 |
3,411 |
3,38 |
98,72-102,59 |
0,418 |
|
31-EPCSP5-203 |
3,53 |
98,8 |
1,566 |
1,59 |
98,72-102,59 |
0,859 |
Conc:
concentración. DS: desviación estándar. CV: coeficiente de variación. R:
recobro.
Linealidad
Durante el estudio de la linealidad, al analizar los gráficos de las
curvas de calibración, se obtuvo un R promedio y un R2
promedio superiores a los establecidos en el criterio de aceptación,(10,11)
(Tabla 5) confirmando la linealidad de las tres experiencias realizadas
en días diferentes, lo que avala la proporcionalidad existente entre la
respuesta analítica y la concentración del analito en el rango analizado de
0,005 - 0,1 mg/mL.
Tabla 5. Evaluación de la
linealidad.
|
Puntos de las curvas |
C (mg/mL) |
DO media |
DS |
CV (%) |
|
|
|
1 |
0,005 |
0,066 |
0,001 |
1,741 |
R (media) |
=0,9982 |
|
2 |
0,010 |
0,132 |
0,004 |
2,779 |
R2
(media) |
=0,9964 |
|
3 |
0,020 |
0,270 |
0,003 |
1,188 |
|
|
|
4 |
0,040 |
0,548 |
0,010 |
1,906 |
|
|
|
5 |
0,080 |
1,030 |
0,016 |
1,572 |
|
|
|
6 |
0,100 |
1,215 |
0,048 |
3,946 |
|
|
C: concentración. DO:
densidad óptica. DS: desviación estándar. CV: coeficiente de variación. R: coeficiente
de correlación. R2: coeficiente de determinación.
Especificidad
Al analizar la especificidad, se observó que en las muestras de
polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae del serotipo 23F no se obtuvo respuesta
cuantificable, puesto que en su estructura no presenta grupos funcionales
(ácido urónico) detectables por el método de
bifenilo, en cambio, sí se obtuvo respuesta para las muestras de polisacárido
serotipo 5 involucrados en esta validación (Tabla 6), lo que indica que el
método es específico, pues la respuesta corresponde exclusivamente al analito
de interés sin interferencias de otro serotipo, excipientes, productos de
degradación y/o impurezas.(10)
Tabla 6. Evaluación de la
especificidad.
|
Muestra serotipo 23F |
DO media |
C (mg/mL) media |
Muestra serotipo 5 |
DO media |
C (mg/mL) media |
|
31
EPCSP23F-901 |
0,002 |
No
cuantificable |
31-EPCSP5-201 |
0,338 |
2,47 |
|
31
EPCSP23F-902 |
0,003 |
No cuantificable |
31-EPCSP5-202 |
0,353 |
2,70 |
|
31
EPCSP23F-903 |
0,002 |
No
cuantificable |
31-EPCSP5-203 |
0,337 |
2,57 |
C: concentración. DO:
densidad óptica.
Conclusiones
Cada parámetro evaluado en esta validación cumple con los criterios de
aceptación establecidos, obteniéndose resultados confiables bajo nuestras
condiciones de trabajo. El método resultó válido y posibilita su aplicación
para el control de calidad de polisacáridos capsulares de Streptococcus
pneumoniae serotipo 5 en el IFV.
Referencias
1. Xu Han, Haiyang Yu, Toledo-Romani ME. Vacunas
antineumocócicas conjugadas: una revisión de las consideraciones éticas e
impacto socio-económico. Rev haban
cienc méd. 2021;20(4):
e3867. Disponible en:
http://scielo.sld.cu/pdf/rhcm/v20n4/1729-519X-rhcm-20-04-e3867.pdf. (Consultado
en línea: 19 de febrero de 2024).
2. WHO. Pneumococcal vaccines: WHO position paper on their use in
community outbreak settings. Wkly Epidemiol Rec. 2021;13:105-10.
Disponible en: https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/340536/WER96013-105-110-eng-fre.pdf?sequence=1.
(Consultado en línea: 19 de febrero de 2024).
3. Campins-Martí M. Vacunas antineumocócicas.
Nuevas vacunas conjugadas para el adulto. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2015;33(9):617-24.
doi: https://10.1016/j.eimc.2015.09.002.
4. Pineda-Solas V. Vacunas conjugadas. Rev Pediatr Aten Primaria. 2005;7 Supl
4:S65-74. Disponible en:
https://pap.es/files/1116-494-pdf/519.pdf. (Consultado
en línea: 6 de marzo de 2024).
5. Cabrera O, Pisonero M, Rodríguez M, Pérez
R, González E, Pedroso J, et al. Dot blot para identidad del polisacárido de Streptococcus
pneumoniae serotipo 14 y toxoide tetánico en
vacunas conjugadas. Cumbres. 2016; 2(2):31-7.
https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=6550719. (Consultado en
línea: 6 de marzo de 2024).
6. Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y
Dispositivos Médicos (CECMED). Requisitos para la liberación de lotes de
vacunas. Regulación No. 19-2000. La Habana: CECMED; 2000.
7. Dirección Europea de la Calidad de los Medicamentos y de la
Asistencia Sanitaria (EDQM). Farmacopea Europea.
Estrasburgo: EDQM; 2011.
8. Blumenkrantz N, Asboe-Hansen G. New method
for quantitative determination of uronic acids. Anal Biochem. 1973;54(2):484-9.
9. Pérez-Calixto M, Suárez-Pérez Y, González-Rodríguez H, Achong-García L, Borrell-Castillo Y. Validación del método
m-hidroxibifenilo para la cuantificación de ácido urónico en polisacáridos purificados de Streptococcus
pneumoniae. Rev Cubana
Farm. 2015; 49(2): 232-44. Disponible en:
http://scielo.sld.cu/pdf/far/v49n2/far05215.pdf. (Consultado en línea: 6 de
marzo de 2024).
10. Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y
Dispositivos Médicos (CECMED). Resolución CECMED No. 40/2014: Anexo No. 1 de
las Buenas Prácticas para Laboratorios de Control de Medicamentos. Validación
de Métodos Analíticos. La Habana: CECMED; 2014.
11. Centro para el Control
Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos (CECMED). Regulación No.
37-2012 Buenas prácticas de laboratorio para el control de medicamentos. La
Habana: CECMED; 2012.
Conflicto de Intereses
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Roles de autoría
Jennifer Caridad Abreu-Vázquez: redactó el
protocolo de la validación, realizó el trabajo experimental, el análisis de
datos, redactó el informe final y el manuscrito.
Janet Zita Pérez-Herrera: realizó el ensayo para
evaluar la precisión intermedia.
Aida Yaima Merchán-Miliá: realizó la revisión final del manuscrito.
Todos los autores revisaron y aprobaron la versión final de este
manuscrito.
* Tecnólogo II Nivel, Departamento de Análisis Físico-Químico,
Dirección de Control de la Calidad, Instituto Finlay
de Vacunas, La Habana, Cuba.