Artículo Original
Establecimiento de la zona
de operación para el cultivo a gran escala de células de ovario de hámster
chino en la obtención de una vacuna viral
Establishment
of the area of operation for large-scale culture of Chinese hamster ovary cells
to obtain a viral vaccine
Jennifer de la Caridad
Quesada-Rodríguez1,2*
ORCID: https://orcid.org/0009-0002-5075-3759
Roberto Rafael Núñez-Ortiz1,2 ORCID: https://orcid.org/0009-0009-8714-9644
José Antonio Fernández de la Vega-Velázquez1 ORCID: https://orcid.org/0009-0004-5726-7440
María Caridad
Duartes-Castro1,2 ORCID:
https://orcid.org/0009-0006-2984-8592
Ernesto Chico-Véliz1,2 ORCID: https://orcid.org/0009-0008-6717-7288
1 Centro de Inmunología Molecular.
La Habana, Cuba.
2 Facultad de Ingeniería Química. Universidad Tecnológica de La
Habana José Antonio Echeverría. La Habana, Cuba.
Autor para correspondencia: jenniferquesadardguez@gmail.com
RESUMEN
El cultivo de células de
mamífero en perfusión se caracteriza por alcanzar mayores densidades celulares
y la más alta productividad. En el Centro de Inmunología
Molecular, con más de 15 años de experiencia en
el empleo de esta tecnología a nivel industrial, se desarrolló el cultivo en
perfusión de células de ovario de hámster chino productoras de la proteína
recombinante rC21 (materia prima biológica empleada en la formulación de una
vacuna viral) en un biorreactor tipo tanque agitado de 2.000 L de volumen
efectivo. La presente investigación se enfocó en establecer la zona de
operación en el cultivo a gran escala a partir de la caracterización de la
ingeniería de procesos, en función de parámetros hidrodinámicos. Se estableció una velocidad
tangencial de 1,41 m/s que implicó operar una potencia por unidad de volumen
alejada de los valores que provocan daño celular. El tamaño de los remolinos
que genera esta condición de agitación es superior al diámetro de las
células de mamíferos, condición que no tiene impacto en el daño celular a partir del criterio de la microescala
de turbulencia de Kolmogorov. La zona de operación
posibilitó alcanzar una alta viabilidad celular y parámetros cinéticos típicos
de las células de mamíferos.
Palabras clave: perfusión; células CHO; reactores biológicos.
ABSTRACT
Mammalian cell culture in
perfusion is characterized by higher cell densities and higher productivity. At
Center of Molecular Immunology, with more than 15 years of experience in the
use of this technology at the industrial level, perfusion culture of Chinese
hamster ovary cells line to produce the recombinant protein rC21 (a biological
raw material used in the formulation of a viral vaccine) was developed in a
stirred tank bioreactor of 2,000 L effective volume. The present investigation
focused on establishing the operating zone in the large-scale culture based on
characterization of the process engineering, as a function of hydrodynamic
parameters. A tangential velocity of 1.41 m/s was established, which implied
operating a power per unit volume far from the values that cause cell damage.
The size of the eddies generated by this agitation condition is larger than the
diameter of mammalian cells, a condition that has no impact on cell damage
according to the Kolmogorov turbulence microscale criteria. The operating zone
made it possible to achieve high cell viability and kinetic parameters typical
of mammalian cells.
Keywords: perfusion; CHO cells;
bioreactors.
Recibido: 24 de junio de 2024
Aceptado: 3 de febrero de 2024
Introducción
El cultivo de células
animales fue desarrollado inicialmente para la producción de vacunas virales y
un número limitado de proteínas naturales como los interferones. El
descubrimiento de la tecnología de producción de anticuerpos monoclonales y los
avances biotecnológicos provocaron una expansión en el número de bioproductos que se obtienen a partir de las células
animales. Estas permiten la producción de manera casi exclusiva de biológicos y
biofármacos complejos (vacunas tradicionales y
recombinantes, proteínas recombinantes glicosiladas, anticuerpos monoclonales,
vectores virales para terapia génica, entre otros). Además, brindan dos
características fundamentales para la actividad de un biofármaco
como son el plegamiento correcto de las proteínas y la glicosilación compleja,
es posible que secreten el biofármaco al medio de
cultivo.(1)
Las células de ovario de
hámster chino (CHO) son la más común elección para la producción de proteínas
recombinantes. Son capaces de alcanzar alta productividad, demuestran fenotipos
de crecimiento consistentemente buenos, se pueden adaptar a medios químicamente
definidos y, por lo general, no generan variantes de productos cuyas
modificaciones postraduccionales presenten una preocupación por la calidad del
producto. Se conoce que esta línea celular carece de enzimas para permitir la
glicosilación terminal observada en las proteínas humanas. Diversos
investigadores han clonado sub-líneas transfectadas con genes que codifican dichas enzimas,
siendo las mismas CHO-K1, CHO-S, CHO-DUKX/B11 y CHO-DG44.(2)
El desarrollo de un proceso biotecnológico es un enfoque sistemático e
iterativo dedicado a la optimización y estandarización de los procesos
utilizados en la producción de biofármacos. En fases
tempranas consiste en la generación y desarrollo de líneas celulares y la
selección del clon principal hasta la conformación de los bancos celulares de
investigación y maestro. Posteriormente ocurre el desarrollo del proceso a
escala piloto para ajustar diversos parámetros como la composición del medio de
cultivo, el pH, la temperatura, la agitación, la aeración, las estrategias de
alimentación y otras variables que afectan la expresión del producto de
interés.(3,4) Además, se debe garantizar que el proceso desarrollado sea escalable
para satisfacer la demanda comercial y que, independientemente de la escala,
sea reproducible con una variación mínima para garantizar la calidad y
eficiencia constante del proceso productivo.
Los bioprocesos para la
producción de proteínas recombinantes a nivel mundial descansan en su mayoría
en el uso de biorreactores tipo tanque con agitación;(5) estos pueden operar en modos diferentes a
partir de varios criterios como: la estabilidad de la línea celular, el tipo de
producto de interés o la complejidad operacional.(5) El Centro de Inmunología Molecular (CIM)
tiene como plataforma productiva el modo continuo con recirculación celular,
pues tiene una potencialidad de alcanzar las mayores densidades celulares y
altas productividades. Además, este modo de operación tiene numerosas ventajas
respecto a los otros; entre las que se incluyen la capacidad de mantener bajos
los niveles de subproductos del metabolismo celular inhibidores del crecimiento
y menor tiempo de residencia del producto, lo cual contribuye a la preservación
de la proteína de interés.(5,6)
En los procesos
biofarmacéuticos, el biorreactor utilizado, así como su diseño, revisten una
gran importancia. El biorreactor es un elemento clave para la optimización del
proceso, ya que en él se llevan a cabo operaciones como la homogeneización, la
dispersión, la suspensión de partículas sólidas y la transferencia de calor. En consecuencia, es
necesario un conocimiento detallado del sistema de cultivo utilizado para el
escalado o la transferencia de procesos, que puede obtenerse mediante la
caracterización de la ingeniería de procesos.(7)
En el CIM se emplea un
biorreactor de 2.000 L de volumen efectivo como plataforma tecnológica para la
producción de anticuerpos monoclonales, mediante el cultivo de la línea celular
murina no secretora (NS0); se requiere
evaluar si esta escala pudiera emplearse como plataforma para la obtención de
vacunas virales. El objetivo de esta investigación fue establecer la zona de
operación en el biorreactor de 2.000 L, mediante la caracterización de la
ingeniería de procesos, para la obtención de la materia prima biológica de una
vacuna viral a partir del cultivo en perfusión de células CHO-K1.
Materiales
y Métodos
Línea
celular
La línea celular utilizada fue la CHO-K1, derivada de un subclón
de la línea CHO parental y productora de la proteína recombinante rC21,
empleada como materia prima biológica para la formulación de una vacuna viral.
Biorreactor
a gran escala
El biorreactor de producción comercial, tiene un volumen de trabajo de
2.000 L (Bioengineering
AG; Suiza), un diámetro (DT) de
1,28 m y la altura del líquido (HL) es de 1,65 m. Este
biorreactor se emplea actualmente como plataforma tecnológica para la obtención
de anticuerpos monoclonales mediante el cultivo de la línea celular NS0.(8) Cuenta con dos impelentes acoplados al mismo eje, una turbina Rushton de seis
paletas (impelente inferior) y una propela marina con tres aspas (impelente
superior), ambos con un diámetro (Di) de 0,45 m.(8)
La temperatura en el
interior del biorreactor se controla mediante un sistema consistente en dos
intercambiadores de calor de placas, que enfrían o calientan el volumen de agua
contenido en la chaqueta. Además, se alimenta una corriente de aire para
mantener una presión constante en el vaso. Los niveles de oxígeno disuelto se
controlan entre el 20 y 100 % de saturación de aire, para el que se alimenta
una mezcla de oxígeno y aire a través del distribuidor de gases.(8)
El biorreactor opera en un primer momento en lote
incrementado y a partir de alcanzar el volumen de trabajo, en modo continuo con retención de biomasa o perfusión.
La
operación de perfusión se desarrolla con el uso de
dispositivos de retención celular, denominados rotofiltros
(cilindros rotarios que giran sobre su eje y permiten la separación celular
para la recirculación hacia el biorreactor) con un diseño
redundante de dos rotofiltros, que trabajan de forma
alterna.(8,9) La Figura 1 muestra un esquema
representativo del biorreactor Bioengineering.
Fig. 1. Esquema representativo de los sistemas tipo tanque
agitado Bioengineering.
Caracterización
de la ingeniería de procesos
El proceso de fermentación a gran escala fue establecido a partir de
caracterizar la zona de operación en cuanto a la hidrodinámica del sistema, de
acuerdo a la metodología de ingeniería de procesos descrita por Dreher y
colaboradores en 2014.(7) Para ello se determinó el régimen de trabajo, la
velocidad en la punta del impelente, la potencia por unidad de volumen
(ecuaciones 1, 2, 3, respectivamente) y el tamaño de los remolinos, un
indicador potencial del daño celular (ecuación 4).
donde:
Re: Número de Reynolds (Re)
N: velocidad de agitación
vtip: velocidad tangencial
P: potencia
V: volumen
ρ: densidad de líquido
Np: número de potencia, es función del tipo de impelente y del régimen
de trabajo
η: viscosidad dinámica
l: tamaño de los remolinos.
Proceso
de fermentación a gran escala
A partir de establecer la
zona de operación para el cultivo de esta línea celular a gran escala, se
desarrolló una corrida de fermentación para analizar el desempeño del cultivo
celular bajo estas condiciones. Se empleó el medio de cultivo libre de proteínas
y de suero animal M-1, análogo al empleado por Hernández y colaboradores en 2010.(10) La temperatura fue controlada a 36,5 ± 0,5 ºC y el pH de 6,5 a 7,2.(8,11,12) El biorreactor fue muestreado diariamente para determinar, por
observación al microscopio mediante el método de exclusión con tripán azul, la
concentración celular (X) y la viabilidad a partir de un inóculo con una
concentración de células vivas de 1,03 x 106 cel/mL y una viabilidad celular de 97,24 % en un volumen de 600
L.
La adición de
medio de cultivo comenzó el segundo día de corrida hasta completar el volumen
de trabajo (2.000 L), en un tiempo aproximado de 24 horas. A partir de este
momento, se inició el cultivo continuo con retención de biomasa a una velocidad
de dilución de 0,30 d-1, la cual se aumentó en función del
incremento en la concentración celular. Con el objetivo de ayudar a mantener un
buen estado fisiológico del cultivo celular, a partir del día 6 se realizaron
purgas a razón de 0,12 d-1 y 0,15 d-1.
Se determinó la velocidad específica de crecimiento celular (µ) a partir de la solución del
balance de masa para la biomasa en modo continuo con recirculación de células y
corriente de purga, en la etapa de crecimiento exponencial (ecuación 5).
donde:
t: tiempo de corrida (d)
X: concentración de células vivas (cel/mL)
α: factor de pase del dispositivo de retención
Dp: velocidad de
dilución de perfusión (d-1)
Dbl: velocidad de
dilución de purga (d-1)
μ: velocidad específica de crecimiento (d-1)
X0 y t0: concentración de células vivas y tiempo
de corrida, al inicio de la perfusión.
La velocidad específica de
perfusión celular (CSPR, por sus siglas en inglés), variable habitualmente
usada en el monitoreo y control de los procesos de fermentación en perfusión,
se determinó a partir de los valores de dilución (D) (ecuación 6).
Influencia
de la aeración
Se
analizó la combinación de la velocidad de agitación y el flujo de gases totales
por volumen de medio de cultivo (vvm) (ecuación 7),
pues los cultivos de células de mamíferos son muy propensos a trabajar en
condiciones de inundación del impelente, caracterizadas por un alto flujo de
aire y baja agitación.(13)
donde:
Q- flujo de gases al distribuidor de gases.
Resultados
y Discusión
Caracterización de la zona operacional en el biorreactor de 2.000 L
La agitación tiene entre sus
funciones, en el biorreactor, mantener la homogeneidad del medio de
fermentación y a las células en suspensión. La homogeneidad se persigue con el
propósito de evitar zonas donde la velocidad de la reacción se vea limitada por
la formación de gradientes que provocan los fenómenos de difusión, de esta
forma se aprovecha eficientemente el volumen efectivo. Estos gradientes pueden
provocar efectos negativos en el crecimiento y en la expresión de la proteína
de interés.(14) El primer parámetro a determinar en el proceso de fermentación de la
línea celular CHO-K1 en el biorreactor de 2.000 L es la velocidad de agitación.
La máxima que permite la operación de este
sistema por diseño original es 100 min-1,(8) no obstante, se ha trabajado a un valor máximo de
80 min-1 en la fermentación de la línea celular NS0 en este
biorreactor, que se
corresponde con una velocidad tangencial de 1,88 m/s.(8) En el cultivo de la línea celular CHO, para
obtener otras proteínas recombinantes en el CIM, se ha empleado una velocidad
tangencial de 1,41 m/s,(12,15) que se encuentra en los intervalos típicos de operación en biorreactores
industriales.(14) Las células de
mamífero son sensibles a los esfuerzos mecánicos por altas intensidades de
agitación que pueden provocar daño celular, por lo que se decide operar a 60
min-1 (1,41 m/s), pues se desconoce el efecto de la agitación en el
desempeño de esta línea celular a gran escala. Diversos autores refieren que en
este tipo de cultivos se deben garantizar velocidades tangenciales no
superiores a 2,50 m/s, para evitar daño celular.(13,16)
En este sentido también se debe considerar la potencia por unidad de
volumen, criterio empleado para el escalado en
los procesos biotecnológicos que se relaciona con las fuerzas de cizallamiento
que ocasionan daño en los cultivos de células de mamífero. Según la ecuación 3,
operar a 1,41 m/s implica una potencia por unidad de volumen de 58,60 W/m3,
valor inferior a 250 W/m3, reportado por Nienow
en 2006(16) para el cual se recomienda trabajar en estos
sistemas, sin afectar la proliferación celular y la expresión de la proteína de
interés.
En la actualidad son manejados varios criterios acerca del daño celular
debido a la agitación; entre los más utilizados se encuentra la microescala de
turbulencia o número de Kolmogorov. La teoría de Kolmogorov identifica al remolino más pequeño o eddie, en función de la velocidad de disipación de energía
y de la viscosidad cinemática del fluido. Mientras menor sea el remolino, mayor
es la cantidad de energía concentrada y, por tanto, mayor daño puede ocasionar
a la célula. Si la célula es más pequeña que la microescala de turbulencia no
será dañada en el momento de la explosión del remolino porque puede acomodarse
en su interior.(16) A partir de la relación de P/V para la
velocidad de agitación de 60 min-1 y la viscosidad cinemática del
agua a la temperatura de trabajo, se determinó que el tamaño de la microescala
de turbulencia de Kolmogorov (ecuación 4) es de 49,80
μm; las células de mamíferos como las de la línea CHO
tienen diámetros de 10-20 μm,(14) por esta razón se pudiera descartar daño
celular bajo la condición propuesta.
A partir de la caracterización del espacio de diseño en el biorreactor
de 2.000 L, se propone emplear una velocidad de agitación de 60 min-1
en la operación de perfusión. De acuerdo a la metodología de trabajo en este
biorreactor para la línea celular NS0, se propone variar la velocidad de
agitación desde 30 min-1 hasta 45 min-1 en función del
volumen de trabajo (500 L a 2.000 L) y una vez iniciado el cultivo continuo con
retención de biomasa operar a 60 min-1.(8)
Fermentación
de la línea celular CHO-K1 en el biorreactor de 2.000 L
Las condiciones de agitación propuestas fueron evaluadas en una corrida
de fermentación de la línea
celular CHO-K1 en el biorreactor de 2.000 L. En la
Figura 2 se muestra el comportamiento de la concentración
celular, la viabilidad y la velocidad de dilución de perfusión y de purga en la corrida de fermentación
desarrollada en el biorreactor de 2.000 L.
Fig. 2. Comportamiento
de la concentración celular, la viabilidad y la velocidad de dilución de la línea celular
CHO-K1 productora de la proteína recombinante rC21, en el medio de cultivo
M-1, en el biorreactor de 2.000 L; temperatura 36,5 ± 0,5ºC, velocidad de agitación 60
min-1, flujo de aire por unidad de volumen de 0,004 min-1, pH 6,5-7,0. X: concentración celular. Dp:
velocidad de dilución de perfusión. Dbl: velocidad de
purga.
En la Figura 2 se observa
que la fase de adaptación fue imperceptible y el final de la etapa exponencial
de crecimiento e inicio del estado pseudoestacionario
se alcanzó en el quinto día de la corrida, a una concentración celular de 8,37
x 106 cel/mL. En
estas condiciones se trabajó a una máxima dilución total de 1,17 d-1
y la concentración celular se mantuvo próxima a 9,00 x 106 cel/mL, análoga a la reportada
por Boggiano-Ayo y colaboradores,(12) para el cultivo de la línea celular CHO-K1 productora de la proteína
recombinante RBD-His en similares condiciones en un
biorreactor de 500 L de volumen efectivo.
La determinación gráfica de la velocidad específica de crecimiento en la
etapa de crecimiento exponencial se muestra en la Figura 3.
Fig. 3. Determinación de la velocidad
específica de crecimiento de la línea celular CHO-K1 productora de la proteína
recombinante rC21, en el medio de cultivo M-1,
en el biorreactor de 2.000 L; temperatura 36,5 ± 0,5 ºC,
velocidad de agitación 60 min-1, flujo de aire por unidad de
volumen de 0,004 min-1, pH 6,5-7,0.
t: tiempo de corrida (d). X: concentración de células vivas (cel/mL). α: factor de pase
del dispositivo de retención. Dp: velocidad de dilución de
perfusión. Dbl: velocidad de dilución de purga. μ: velocidad específica de
crecimiento.
El valor de la velocidad específica de crecimiento en el cultivo
continuo con retención de biomasa en la etapa de crecimiento (0,38 ± 0,04 d-1)
se encuentra en el intervalo típico de la velocidad específica de crecimiento
en los cultivos de células de mamíferos de 0,20 d-1a 0,50 d-1.(5,11,17,18) Se obtiene un buen ajuste en la determinación de la µ con un
coeficiente R2 de 97 %.
Por su parte, la velocidad específica de perfusión celular fue de 0,1 5 ±
0,015 nL/cel/d. Esta variable representa
el volumen de medio de cultivo consumido por una célula en un día y tiene gran
influencia en la estabilidad y mantenimiento de un adecuado ambiente para el
crecimiento celular y la continua producción de la proteína de interés. Su
valor se encuentra en el intervalo referido por Boggiano-Ayo y colaboradores(12) y por Konstantinov y colaboradores(19) de 0,05 a
0,50 nL/cel/d, para el
cultivo de células de mamíferos.
Influencia
de los parámetros de operación en el desempeño de la línea celular CHO-K1 a
gran escala
En la Figura 4 se muestra la zona de operación en cuanto a la
concentración celular y la viabilidad en función de las condiciones de aeración
y agitación en el biorreactor de 2.000 L.
Fig. 4. Zona de operación en
función de la velocidad tangencial (vtips)
y el flujo de gases totales por volumen de medio de cultivo (vvm) de la línea
celular CHO-K1 productora de la proteína recombinante rC21, en el medio de cultivo
M-1, en el biorreactor de 2.000 L; temperatura 36,5 ± 0,5 ºC,
pH 6,5-7,0. A. comportamiento
de la concentración celular (X). B. comportamiento de la viabilidad.
El valor máximo de flujo de
aire por volumen de medio de cultivo al cual se operó fue de 0,0049 min-1
(dado fundamentalmente por el flujo de oxígeno que demanda el cultivo celular).
Este es otro de los parámetros que influye en el adecuado desempeño del
crecimiento celular. El criterio de los límites en los que se debe operar varía
de acuerdo a las características del sistema y la línea celular. Nienow en 2006(16) refirió que es posible trabajar a un flujo de gases por volumen de
medio de 0,010 min-1 en sistemas con macroburbujeadores
de tubo sin que se evidencie daño en el cultivo celular. La zona de operación
establecida por la combinación de la velocidad tangencial y el flujo de gases
por volumen de medio no tuvo impacto en el desempeño de la línea celular CHO-K1
a gran escala; se obtuvieron viabilidades celulares superiores al 97 % y se
alcanzaron concentraciones celulares cercanas a 9,00 x 106 cel/mL. Esta zona de operación se
corresponde con la del cultivo de otra línea celular en este sistema para la
obtención del anticuerpo monoclonal nimotuzumab.(8)
Las condiciones de bajas velocidades de agitación y relativamente altos
valores de flujo de aire, son condiciones típicas de inundación del impelente,
donde la corriente de aire domina el flujo del sistema. Este fenómeno hace
ineficiente la dispersión del gas, pues disminuye bruscamente la velocidad de
transferencia de masa gas-líquido y la retención del gas en el volumen del
líquido, lo cual es una condición indeseable.(14,16) Raffo y colaboradores(13) establecieron
las zonas de operación en un biorreactor de 1.100 L para garantizar una
adecuada dispersión del aire, en función del flujo de gases y la velocidad de
agitación. Se toma como referencia la zona de operación establecida por Raffo y colaboradores,(13) a partir de
curvas empíricas obtenidas por otros investigadores(20,21,22) para
condiciones de inundación, y se insertan los puntos de operación de la
fermentación en el biorreactor de 2.000 L para analizar si la combinación de estos dos
parámetros (agitación y aeración) garantiza una adecuada dispersión de aire en
el sistema (Fig. 5).
Fig. 5. Velocidad tangencial (vtips) mínima
para lograr la dispersión del aire en función del flujo de gases totales por
volumen de medio de cultivo (vvm) de la línea celular CHO-K1 productora de la
proteína recombinante rC21, en el medio de cultivo M-1,
en el biorreactor de 2.000 L; temperatura 36,5 ± 0,5ºC, pH 6,5-7,0. Adaptado de Raffo y colaboradores.(13)
Los puntos de operación en la Figura 5 se
encuentran por encima de las curvas de la literatura para representar la frontera entre las condiciones de
dispersión y de inundación, y alejados de esta condición, por lo que la
oxigenación del cultivo celular ocurre eficientemente.
Conclusiones
La escala de fermentación de 2.000 L empleada actualmente en la obtención
de anticuerpos monoclonales puede emplearse como plataforma para la producción
de vacunas virales, a partir del cultivo de la línea celular CHO-K1.
Se propuso una zona de
operación para el proceso de fermentación a gran escala de la línea celular CHO-K1
productora de la proteína recombinante rC21, a partir de la caracterización de
la ingeniería del proceso. La velocidad tangencial propuesta (1,41 m/s), en
combinación con el flujo de aire posibilitó un desempeño favorable de los
procesos de transferencia en este sistema y del crecimiento celular, con
valores típicos en los parámetros cinéticos del cultivo de células de mamíferos.
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Conflicto de Intereses
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Roles de autoría
Jennifer de la Caridad
Quesada-Rodríguez: conceptualización, procesamiento de los datos, análisis de
resultados y redacción.
Roberto Rafael Núñez-Ortiz:
conceptualización, supervisión, redacción, revisión.
José Antonio Fernández de
la Vega-Velázquez: experimentación, supervisión, revisión.
María Caridad
Duartes-Castro: experimentación, supervisión, revisión.
Ernesto Chico-Véliz:
conceptualización, supervisión, revisión.
Todos los autores revisaron y aprobaron la versión final de este manuscrito.
* Máster en Procesos Biotecnológicos, Especialista III
en Investigación, Innovación y Desarrollo, Profesor Instructor. Centro de Inmunología Molecular. La Habana, Cuba.