Artículo Original
Ensayo de
inmunogenicidad y toxicidad aguda del candidato
vacunal contra el cólera vax-COLER®
Immunogenicity and acute toxicity assay of the vaccine
candidate against cholera vax-COLER®
Reynaldo
Oliva-Hernández*
Juan
F. Infante-Bourzac
Luis
García-Imias
Hilda M García-Sánchez
Bárbara Cedré-Marrero
Victoriano Gustavo Sierra-González
Instituto Finlay de Vacunas, La Habana, Cuba.
Autor para correspondencia: roh@finlay.edu.cu; reyolivacuba@gmail.com
RESUMEN
Para el control y
prevención
del cólera humano se han llevado a cabo diferentes estrategias, entre las
cuales, la vacunación es una
de las medidas más eficaces. La
evaluación preclínica
de candidatos vacunales requiere de la demostración de la seguridad de los mismos, para lo cual
los estudios toxicológicos son determinantes, al ser obligatorios
y altamente regulados. Este estudio tuvo como objetivo demostrar
la relevancia de las ratas Sprague
Dawley como biomodelo a través de su respuesta inmunológica al candidato
vacunal contra el cólera, vax-COLER®, utilizando la técnica de determinación de anticuerpos vibriocidas. Además, evaluar los efectos
toxicológicos locales y sistémicos por la administración de una dosis de vax-COLER® a través de la evaluación de síntomas, del consumo de
agua y alimentos, el peso corporal y estudios anatomopatológicos. La vacuna vax-COLER® resultó inmunogénica y no evidenció síntomas ni
muertes, no hubo cambios en el peso corporal y los consumos de agua y alimentos
se comportaron de forma similar entre todos los grupos. Los estudios
anatomopatológicos solo
mostraron cambios a nivel histológico en los ganglios linfáticos
mesentéricos y placas de Peyer de los animales vacunados, con presencia de
hiperplasia de los folículos secundarios subcapsulares, hallazgo que difirió
significativamente con el resto de los grupos. Se concluye que la vacuna
vax-COLER® es inmunogénica en ratas Sprague Dawley, demostrando la
relevancia del biomodelo para la evaluación de la seguridad preclínica y que la
aplicación de una dosis no produjo efectos tóxicos agudos generales ni locales.
Palabras Claves:
inmunogenicidad vacunal; pruebas de toxicidad aguda; vacunas contra el cólera; Vibrio cholerae; ratas Sprague-Dawley.
ABSTRACT
Different strategies have been carried out for the
control and prevention of human cholera. Vaccination is one of the most
effective strategies. Preclinical evaluation of vaccines needs to prove their safety;
whereby toxicological studies are decisive. They are mandatory and highly
regulated. This study was aimed to demonstrate the relevance of Sprague Dawley
rats as a biomodel, through the immunological response to vax-COLER®
cholera vaccine, using the technique of determination of vibriocidal
antibodies. In addition, local and systemic toxicological effects were
evaluated after administration of a dose of vax-COLER®; through the
evaluation of symptoms, water and food consumption, body weight and
anatomopathological studies. The vax-COLER® vaccine was immunogenic
and showed no symptoms or deaths. No changes in body weight were detected, and
food and water consumption were similar among all groups. The
anatomopathological studies showed histological changes in the mesenteric lymph
nodes and Peyer's patches of the vaccinated animals, with hyperplasia of the
subcapsular secondary follicles, finding that differed significantly from the
rest of the groups. It is concluded that vax-COLER® vaccine is
immunogenic in Sprague-Dawley rats, demonstrating the relevance of the biomodel
for the evaluation of preclinical safety, as well as that the application of a
single dose did not produce acute general or local toxic effects.
Keywords: vaccine immunogenicity; acute toxicity
tests; cholera vaccines; Vibrio cholerae;
Sprague-Dawley rats.
Recibido: 24 de octubre de 2019
Aceptado: 21 de enero de 2020
Introducción
El cólera humano es una enfermedad diarreica aguda, caracterizada
por diarreas profusas con apariencia
de agua de arroz. La forma clínica más severa cursa por
una
rápida pérdida de líquido y electrolitos a través del tracto gastrointestinal que, de no tratarse adecuadamente, conduce al choque
hipovolémico, acidosis metabólica e incluso,
a la muerte
en poco tiempo.(1)
La situación actual a nivel mundial del cólera sigue siendo un problema aún por resolver, lo cual se
evidencia en el reporte anual de la Organización Mundial de
la Salud (OMS) que registró durante el año 2017 un total de 1.227.391 casos de
cólera con 5654 muertes en 42 países. Estas cifras representan
un crecimiento del 45% con respecto al año 2016
(172.454 casos) y se estiman de
1,3 - 4,0 millones de casos de cólera y alrededor de 143.000 muertes, cada año en todo el mundo. Estos
datos se consideran subestimados por la notificación incompleta,
a menudo debido al temor de
impacto negativo en los viajes y
el
comercio en las zonas afectadas,(2,3) a lo que se suma el estimado en costo de entre 15 y
206 dólares americanos de cada ingreso hospitalario por cólera y la atención medica correspondiente.(4)
Independientemente
de las medidas sanitarias que se puedan tomar, tanto para la prevención como
para la erradicación de la enfermedad en los países donde el cólera es
endémico, estas medidas no son suficientes. Entonces, las vacunas entran a
tener un rol determinante en la prevención. Las únicas vacunas comercialmente disponibles corresponden a tres variantes de células muertas y
que fueron precalificadas por la OMS (Dukoral®, Shanchol® y Euvichicol®).(5) Estas vacunas son
seguras, fáciles de
administrar e inductoras de
eventos adversos mínimos, pero precisan de dos o
tres dosis, por lo que la logística del proceso de vacunación constituye una barrera significativa para su empleo en situaciones
epidémicas. Además, para mantener un nivel adecuado de protección son necesarias intervenciones de refuerzo cada 2 o 3 años,(6)
lo cual limita
su uso, ya que los costos fundamentales de las campañas de vacunación se asocian con la distribución de la vacuna, más que con su costo
de fabricación.
Las
vacunas de microorganismos vivos contra el cólera humano podrían tener la ventaja
de que la administración de una única dosis brinden una protección inmunológica duradera más prolongada, dada la similitud con el proceso de infección natural, lo que evitaría
el
régimen de múltiples dosis.(6)
En Cuba, como resultado
de un proyecto de colaboración entre el Centro Nacional
de Investigaciones Científicas (CNIC), el
Instituto Finlay de Vacunas (IFV)
y el Instituto de Medicina
Tropical “Pedro Kourí” (IPK), se
obtuvieron un grupo de cepas de V. cholerae de los serogrupos O1 y O139 atenuadas genéticamente, como posibles
candidatos vacunales orales contra
el cólera.(7)
La cepa 638 V. cholerae
O1 El Tor Ogawa atenuada genéticamente se seleccionó como ingrediente farmacéutico activo (IFA) del candidato vacunal vax-COLER®; además
de ser la cepa que mejores resultados mostró, luego de someterse a una compleja
batería analítica junto a otras cepas de similares características; por ser del biotipo, serogrupo y serotipo
de mayor circulación mundial.(2,5)
Luego del desarrollo tecnológico y farmacéutico de la cepa atenuada 638 como vacuna de células
enteras vivas atenuadas, quedó demostrado en
biomodelos animales su eficacia
preclínica.(8) Este resultado permitió iniciar los estudios obligatorios
de seguridad preclínica, exigidos por
las entidades
reguladoras nacionales e internacionales para evidenciar su no toxicidad antes de su desarrollo clínico.
Este estudio tuvo como objetivo
demostrar la relevancia de las ratas Sprague Dawley (SD) como biomodelo, a través de su respuesta
inmunológica frente al candidato vacunal contra el cólera humano utilizando la
técnica de determinación de anticuerpos vibriocidas; además, evaluar los
posibles efectos adversos toxicológicos locales y sistémicos causados por la administración
de una dosis de este producto.
Materiales y Métodos
Animales y condiciones de tenencia
Se utilizaron ratas SD de ambos sexos
procedentes del CENPALAB (Centro Nacional para la Producción de Animales del
Laboratorio, La Habana, Cuba) con su correspondiente certificado de salud y
zootecnia, de 6-7 semanas de edad, las cuales se alojaron en cajas para ratas
de Tecniplast® (Dimensiones y modelo: 1354G Eurostandard Tipo IV,
595 x 380 x 200 mm, superficie de suelo de 1820 cm, plástico PEI y sin BPA,
Italia) en el bioterio de investigaciones del IFV. A las ratas se les
proporcionó alimento especializado para roedores estéril (ALYco®,
CENPALAB, Cuba) y agua estéril en frascos de 750 mL. Tanto la comida como el
agua estuvieron disponibles ad libitum.
La habitación de los animales se mantuvo a una temperatura de 22±2ºC y una
humedad relativa de 55±5%. Estos parámetros se registraron diariamente; además
de mantener ciclos de luz y oscuridad de 12 h. Los animales se aclimataron
durante una semana antes del comienzo del protocolo experimental y se colocaron
al azar en grupos de 10. El protocolo del ensayo fue aprobado por el “Comité
Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio”, por el “Comité
de Bioseguridad” y supervisado por el “Departamento de Control de la Calidad”
del IFV.
Formulación de vax-COLER® y diseño
experimental
La sustancia de ensayo fue el candidato vacunal vax-COLER® contra el cólera humano, cuyo IFA es la cepa atenuada 638 V.
cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Ogawa. La misma se presenta en forma de
una pastilla liofilizada. En la Tabla 1, se resume la composición del producto
a evaluar.
Tabla 1. Composición del
candidato vacunal vax-COLER® en estudio.
|
Nombre
Genérico |
Composición por unidad de dosis† (2 mL)* |
|
|
Sustancias
Activasa |
Sustancias
auxiliaresb |
|
|
Vacuna viva atenuada contra cólera |
- Bacterias atenuadas de Vibrio
cholerae O1, biotipo El Tor, serotipo Ogawa, modificadas genéticamente, (1-5x109UFC)† - Peptona
de carne 40 mg1 - Leche
descremada 120 mg2 -
Sorbitol 40 mg3 |
- Cloruro de sodio 9 mg - Bicarbonato de sodio 26,6 mg - Ácido ascórbico 0,0165 mg -
Agua natural embotellada 2 mL |
†: Dosis de antígenos en la formulación en Unidades
Formadoras de Colonias (UFC).
a: Composición de la IFA en el
liofilizado.
b: Solución antiácida utilizada como
placebo
1, 2 y 3: Componentes de la
liofilización.
*: Volumen total de la
mezcla del liofilizado con la solución anti-ácida y para el grupo control (solución salina fisiológica al 0,9 %).
El estudio se diseñó teniendo en
cuenta las principales regulaciones y guías emitidas por el “Consejo
Internacional de Armonización” (del inglés ICH: International Council for Harmonisation), la Agencia Europea de Medicamentos (del
inglés EMEA: European Medicines Agency) y la OMS.(9,10,11)
En el ensayo se incluyeron animales no inmunizados con
el producto, los cuales recibieron en igual volumen (2 mL) solución salina
fisiológica al 0,9 % (controles) o solución placebo (sustancias auxiliares de
la formulación sin el antígeno). Mientras que los animales vacunados recibieron
la dosis humana propuesta (1-5x109 UFC). Este diseño permitió no solo el control de las
condiciones de inmunización, sino también evaluar los posibles efectos adversos
potenciales que pudieran desarrollarse en el curso del experimento.
Se empleó la vía oral por ser la
propuesta a utilizar en humanos, en dosis y volumen descritos anteriormente;
teniendo en cuenta el peso y las relaciones
alométricas entre el hombre y el biomodelo experimental utilizado. Se consideró
que la dosis aplicada permite evaluar la seguridad del candidato vacunal con un
margen satisfactorio,(12) tomando
como promedio animales de 200 g de peso vivo, esta dosis representó más de 300
veces la dosis humana de un individuo de 70 kg de peso. El
candidato vacunal se aplicó con una cánula curva, con punta roma (medida: 16x3”
(76,2 MM) W/3, China) diseñada para la administración oral en ratas y en la
Tabla 2 se resume el diseño experimental.
Tabla 2. Diseño experimental del ensayo de
inmunogenicidad y toxicidad aguda al candidato vacunal vax-COLER® en
ratas SD.
|
Tratamiento |
Sexo |
n
de animales |
Volumen
administración oral |
n
de eutanasia/día |
|
Control (SSF) |
Hembra |
10 |
2 mL |
10/14 |
|
Macho |
10 |
2 mL |
10/14 |
|
|
Placebo |
Hembra |
10 |
2 mL |
10/14 |
|
Macho |
10 |
2 mL |
10/14 |
|
|
vax-COLER® |
Hembra |
15a |
2 mL |
10/14 5/28 |
|
Macho |
15a |
2 mL |
10/14 5/28 |
SSF: Solución Salina Fisiológica al 0,9%, n: número,
a: 5 animales para evaluación inmunológica y centinelas del ensayo.
Observaciones clínicas, peso
corporal, consumos de agua y alimentos
Los animales se sometieron
a exploración clínica dos veces al día durante las primeras 72 h y luego diariamente durante todo el tiempo que
duró el ensayo, comenzando a realizar la misma a partir de la administración del producto,
considerado este como el momento en que se empezaron a tomar los primeros datos
del estudio y de acuerdo al diseño del protocolo aprobado.
En el momento de la inoculación se pesaron los
animales, para conocer el peso real de los mismos al comienzo del ensayo. Se
realizaron pesajes a todos los animales a intervalos semanales (0,
7, y 14 días post-inoculación) hasta su
conclusión, con registro de forma individual por grupo y tratamiento.
El consumo de agua y alimentos se
realizó midiendo los volúmenes consumidos en días alternos. Los procedimientos
y cálculos de estos parámetros se realizaron de forma similar a reportes
anteriores.(13) Se utilizaron balanzas técnicas (Sartorius,
Alemania) para el peso de los animales y el alimento.
Determinación de anticuerpos
vibriocidas
De
los 15 animales inmunizados con vax-COLER®,
se utilizaron cinco para obtener muestras de sangre en los tiempos 0, 7,
14, 21 y 28, para realizar el estudio cinético de la respuesta de anticuerpos vibriocidas;
además, estos animales tuvieron la finalidad de ser los centinelas del estudio,
en caso de observarse efectos adversos a nivel fisiológico o
anatomopatológico, poder determinar la reversión de los mismos. En el resto de
los animales se recolectó la sangre en la eutanasia del día 14, en viales de
1,5 mL (Ependorf ®, Alemania) sin anticoagulante, se centrifugó para
la obtención de suero y se conservó a -20ºC hasta el momento de realizar la
medición de los títulos de anticuerpos vibriocidas por el método modificado de
Cedré y col.,(14) el cual consiste en la siembra de la(s) cepa
control(s) de V. cholerae un día
antes de la evaluación de los sueros en placas de Agar Cerebro Corazón (BHI, Biocen,
Cuba), incubar a 37ºC durante toda la noche, junto con cuatro cuñas del mismo
medio sin inocular. Posteriormente, se pasan colonias aisladas de las placas a
las cuñas precalentadas y se incuban durante 4 h a 37°C. El crecimiento
bacteriano se recoge con solución salina estéril 0,85% y la suspensión celular
se ajusta en un espectrofotómetro a una densidad óptica entre 0,9 y 0,95 a una
longitud de onda de 550 nm. Esta suspensión se diluye 1:10 y se mezcla con
igual volumen de complemento humano diluido 1:5. Luego se añaden 25 μL de esta
mezcla en una placa de microtitulación estéril en la que antes se habían
realizado diluciones de los sueros a evaluar desde 1:10 hasta 1:20.480 en
solución salina. La placa se incuba 1 h a 37ºC y luego se añaden 150 μL por
pozo de medio BHI que contiene glucosa y púrpura de bromocresol en solución,
ambos al 2%. Se incuba de nuevo durante 4 h y se procede a la lectura por
observación visual. El título de anticuerpos vibriocidas se define como el
recíproco de la dilución mayor del suero, en la que se observa inhibición
completa del crecimiento bacteriano, reflejado por la invariabilidad del color
del medio de cultivo.
La evaluación de los títulos de
anticuerpos vibriocidas se realizó individualmente a cada animal y se
compararon los resultados del grupo vacunado con los placebos y controles.
Estudios anatomopatológicos
Dos semanas después de la
inmunización se realizó la eutanasia de todos los animales por sobredosis de tiopental
sódico en dosis de 100 mg/kg vía intravenosa y desangrado, excepto los cinco
animales vacunados de cada sexo empleados para evaluar la cinética de
producción de anticuerpos y como centinelas del
estudio. Se efectuó la necropsia y se procedió a examinar todos los órganos;
seguidamente se tomaron muestras de esófago, estómago, intestino delgado,
intestino grueso y de los ganglios linfáticos mesentéricos por su relación
directa con la vía oral. Se concibió tomar muestras de aquellos órganos o
tejidos con alguna alteración al análisis macroscópico
Para los estudios
histopatológicos se procedió de forma rutinaria como se ha descrito en trabajos
anteriores.(13) Debido a que la identificación de
las muestras fue codificada, al ser un requisito en los estudios de seguridad
toxicológica preclínica, las evaluaciones histopatológicas se realizaron a
ciegas, los hallazgos se registraron en los modelos de datos primarios y una
vez terminados los estudios se abrieron los códigos para realizar la interpretación
de los resultados.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó
utilizando el sistema R, versión 3.1.0 (2014-04-10), con un nivel de
significación estadística del 0,05 para todas las comparaciones. Para el
análisis de la respuesta inmunológica se calculó la media geométrica de los
títulos y se realizó ANOVA simple para comparar la media de los logaritmos de
los títulos obtenidos por el ensayo vibriocida.
Para los estudios
toxicológicos las variables usadas para la interpretación estadística fueron el peso corporal, el consumo promedio de agua bebida, alimento y
hallazgos histopatológicos. En todos los casos como características
descriptivas se estimaron las medidas de tendencia central y dispersión (media,
desviación estándar, valores máximos y mínimos).
Para los análisis se
verificaron en cada sexo los supuestos de normalidad (pruebas de
Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk) y homogeneidad de varianzas (prueba de
Levene). Para las distribuciones normales, se aplicó un análisis de varianza (ANOVA).
Si no cumplían con estos criterios, se usó la alternativa no paramétrica
(prueba de Kruskal Wallis). Además, en los casos necesarios se realizaron
comparaciones pareadas en los intervalos consecutivos de tiempo, utilizando la
prueba t pareada o la prueba de
Wilcoxon, en función del cumplimiento del supuesto de aproximación por una
distribución normal. En los casos en que se detectaron diferencias entre los
grupos de manera global, se aplicó la prueba de comparaciones múltiples de LSD
o prueba de Dunn, en dependencia del cumplimiento de los supuestos
distribucionales. Los datos resultantes del estudio histopatológico fueron
analizados a través de la construcción de las tablas de clasificación cruzadas,
con la prueba de independencia asociada (prueba exacta de Fisher).
Resultados
Observaciones clínicas, peso
corporal, consumos de agua y alimentos
No se registraron síntomas clínicos ni muertes;
mientras que el peso corporal, luego de su registro al comienzo del ensayo y
después de aplicar el producto a las ratas, fue como promedio 202 g en las
hembras y 220 g en los machos; todos los animales incrementaron
el peso corporal durante el tiempo que duró el ensayo, siendo los machos los
que mostraron un ritmo de crecimiento mayor (interacción sexo-tiempo
significativa, p=0,031). Sin embargo, no fue significativa la interacción entre
los factores sexo y tratamiento en cuanto a peso vivo se refiere (p≥0,05). En
la Tabla 3 se muestra que no se evidencian diferencias significativas entre los
grupos experimentales.
Los consumos de agua y alimentos
se comportaron de forma similar entre todos los grupos en estudio, sin
evidenciar diferencias estadísticas. De igual forma, al realizar el análisis
por sexo respecto al consumo de agua (p=0,4367); machos 37,7 mL y hembras 34,4
mL. Sin embargo, si se demostró respecto al consumo de alimentos (p=0,0001), al
ser como promedio superior en los machos (26,4 g) que en las hembras (16,7 g),
como era de esperar acorde a su fisiología y como ha sido reportado en estudios
similares.(13) Por otra parte, no se observaron interacciones
significativas entre el sexo y el tratamiento para estos dos parámetros, que
pudieran indicar algún efecto del tratamiento asociado al sexo (Tabla 3).
Tabla 3: Valor
promedio del peso corporal, consumo de agua y alimentos en las ratas SD (media
± DE) y valores de p entre los grupos.
|
Grupos |
Sexo |
Variables |
||||||
|
Peso
corporal (g)/Días |
Agua
(mL)/Días |
Comida
(g)/Días |
||||||
|
0 |
7 |
14 |
7 |
14 |
7 |
14 |
||
|
Control |
Hembra |
201,4±10,02 |
206,0±7,27 |
219,1±11,94 |
33,0 ± 7,9 |
37,5 ±2,73 |
14,5±2,46 |
18,3±2,72 |
|
Macho |
216,4±17,50 |
273,5±16,88 |
317,8±20,84 |
32,5±2,44 |
36,7±6,05 |
25,4±2,47 |
27,4±1,42 |
|
|
Placebo |
Hembra |
204,5±7,86 |
206,6±9,47 |
220,6±13,20 |
32,5±4,37 |
39.5±2,58 |
14,7±2,61 |
18,3±2,43 |
|
Macho |
221,7±20,56 |
277,6±26,23 |
324,8±30,73 |
30,9±3,13 |
39,0±4,85 |
25,0±1,88 |
27,7±1,32 |
|
|
vax-COLER® |
Hembra |
199,0±12,11 |
204,7±13,77 |
219,8±11,14 |
28,0±4,59 |
36,2±5,56 |
15,3±2,98 |
18,8±2,13 |
|
Macho |
222,0±18,25 |
272,3±16,83 |
325,4±25,51 |
35,9±4,67 |
39,2±7,52 |
26,0±2,35 |
26,8±0,90 |
|
|
Valor
de p |
Hembras |
0,5911 |
0,7605 |
0,7945 |
0,1797 |
0,4466 |
0,7743 |
0,8752 |
|
Machos |
0,8628 |
0,9487 |
0,8698 |
0,0787 |
0,7409 |
0,5353 |
0,2649 |
|
Los datos del consumo de agua y alimentos se evaluaron
en días alternos y se agruparon por semanas para facilitar el análisis
estadístico. La prueba estadística de Kruskal-Wallis se usó para comparar todas
las variables.
Evaluaciones inmunológicas
Previo a la inmunización, no se
detectó la presencia de anticuerpos vibriocidas por la técnica empleada en
ninguno de los animales en estudio. En cambio, 7 días después se logra detectar
en los animales vacunados utilizados para la cinética de anticuerpos, una
respuesta promedio para ambos sexos de 240 de los títulos medios geométricos
(TMG), con su máxima exponencial que promedió 532 de los TMG a los 14 días,
luego estos títulos declinan progresivamente para alcanzar niveles estables más
bajos a 182 de los TMG como promedio después de los 21 días; sin observarse
diferencias significativas entre hembras y machos (p≥0,05; Fig. 1).
Fig. 1. Cinética de anticuerpos (Acs) vibriocidas, media geométrica de
los títulos (TMG) en ratas SD vacunadas. Cada valor representa la media de 5
animales y el error estándar de la media de cada sexo. Prueba estadística de
Wilcoxon; p≥ 0,05.
Por su parte, los controles y los
placebos que fueron muestreados a los 14 días post-inoculación, no presentan
anticuerpos detectables y los inmunizados tuvieron títulos similares a los de
la cinética para ese tiempo, observándose diferencias significativas (p=0,001;
Fig. 2).
Fig.
2. Media geométrica de los títulos (TMG) de anticuerpos (Acs)
vibriocidas en ratas SD. Cada valor representa la media de 10 animales y el
error estándar de la media de cada grupo. Prueba estadística de Kruskal-Wallis
(p≤0,05).
Estudios anatomopatológicos
Los estudios anatomopatológicos no
revelaron alteraciones macroscópicas en los animales a los que se les realizó
la eutanasia a los 14 días después de la administración del producto, ni en los
animales vacunados centinelas, al concluir la cinética de anticuerpos (28 días
post-inoculación). A pesar
de ello, para valorar posibles cambios locales imperceptibles en la
necropsia, se decidió tomar muestras del tracto gastrointestinal y de los
ganglios linfáticos mesentéricos en el 50% de los animales de cada grupo,
atendiendo a los recursos disponibles y considerando que en un estudio de
toxicidad aguda no se exige la evaluación histopatológica de todos los órganos
a los animales. No se encontraron lesiones histológicas en el sistema
digestivo, mientras que en los ganglios linfáticos mesentéricos de los animales
vacunados, se pudo observar hiperplasia de los folículos secundarios
subcapsulares y en algunos casos la presencia de abundantes células plasmáticas
y cebadas en la zona del íleo, así como, hiperplasia de las placas de Peyer y
presencia de centros germinativos (Fig. 3).
Fig.
3. Evaluación histopatológica. I:
Ganglio mesentérico y II: Placa de Peyer de rata SD del grupo vacunado,
a: Folículos secundarios subcapsulares, Cg: Centro germinativo.
Flechas indican hiperplasia hacia la luz de la mucosa intestinal. H.E x 10.
La frecuencia de estos cambios en
los ganglios mesentéricos fue significativamente mayor en el grupo de animales
vacunados, en comparación con los placebos y controles (Tabla 4).
Tabla
4. Frecuencia de animales con hiperplasia
de los folículos linfoides secundarios subcapsulares y/o presencia de células
plasmáticas y cebadas en los ganglios linfáticos mesentéricos de ratas SD a los
14 días post-inoculación.
|
Cambios histológicos |
Hembras |
n Total |
||
|
Controles1 |
Placebos2 |
vax-COLER®3 |
||
|
Hiperplasia
de los folículos linfoides subcapsulares |
1/5 |
1/5 |
4/5 |
6/15 |
|
Presencia
de células plasmáticas y cebadas |
0/5 |
0/5 |
2/5 |
2/15 |
|
Cambios histológicos |
Machos |
n Total |
||
|
Controles1 |
Placebos2 |
vax-COLER®3 |
||
|
Hiperplasia
de los folículos linfoides subcapsulares |
1/5 |
0/5 |
5/5 |
6/15 |
|
Presencia
de células plasmáticas y cebadas |
0/5 |
1/5 |
2/5 |
3/15 |
|
General |
2/10a |
2/10b |
13/10c |
|
1, 2 y 3: Tratamientos; n- número de animales; Prueba exacta de
Fisher p≤ 0,05, ab: p= 0,86, bc: p= 0,032 ac: p= 0,054.
General. Se describen todos los hallazgos por
grupo.
Discusión
Las ratas inmunizadas con el
candidato vacunal vax-COLER®, no mostraron síntomas de toxicidad ni
reacciones adversas asociadas a la patología provocada por cepas de V. cholerae. Aunque, destacamos que era
poco probable que los animales mostraran síntomas gastrointestinales a
consecuencia de la colonización de V.
cholerae en el tracto gastrointestinal, debido a que las ratas adultas,
como el resto de las especies de animales de laboratorio, no son susceptibles a
la infección natural por esta bacteria. Además, al tratarse de un
microorganismo cuya virulencia ha sido considerablemente atenuada, es incluso
menos probable encontrar efectos adversos ligados a su patogenicidad. No
obstante, no se hicieron ostensibles efectos locales (gastrointestinales)
indeseables que pudieran relacionarse con la formulación vacunal, las
sustancias antiácidas o componentes del proceso productivo.
Los estudios inmunológicos permitieron establecer un modelo animal
relevante para evaluar la seguridad toxicológica del candidato vacunal, ya que
en ellos se demostró que la rata SD desarrolla una respuesta inmune similar a
la esperada en humanos luego de la aplicación del candidato vacunal,(15) elemento que permitió cumplir con las
recomendaciones emitidas por la OMS para estudios preclínicos en vacunas.(10)
El peso corporal es habitualmente
evaluado en los estudios toxicológicos para vacunas, ya que como es conocido
este es un parámetro sensible y general de la toxicidad de los xenobióticos.
Así, el peso alcanzado por las ratas en el período estudiado se correspondió
con los valores históricos observados para ratas SD en las instalaciones del
IFV durante la evaluación preclínica de otros productos y con las curvas de
crecimientos reportadas para esta especie.(13,16) De forma similar
ocurrió con los consumos de agua y alimentos, al corresponderse los resultados
con los valores históricos observados para las ratas de esta categoría en
nuestras instalaciones.(13,16) Estos elementos apuntan a la ausencia
de toxicidad del candidato vacunal vax-COLER® contra el cólera.
El conejo ha sido el biomodelo más
utilizado en estudios de inmunogenicidad contra cólera.(17) Sin
embargo, para lograr una respuesta inmune satisfactoria se requiere de la
inoculación transduodenal por medio de una laparotomía media, lo cual quita
valor práctico y técnico al modelo desde el punto de vista toxicológico.
Existen referencias sobre el uso
de la rata para estudios de inmunogenicidad de candidatos vacunales contra
cólera, en los que se ha descrito que responden inmunológicamente a células
enteras o inactivadas, a la toxina colérica y a otros antígenos, ya sean
aislados o en combinaciones.(16, 18,19,20) No obstante, fue preciso
demostrar que esta especie responde también frente al candidato vacunal
vax-COLER®. Por ello, se desarrolló este estudio de inmunogenicidad
en el que se midieron los títulos de anticuerpos vibriocidas luego de la
administración de una dosis oral de esta formulación.
En otros estudios llevados a cabo
en ratas SD en los que se evaluó la inmunogenicidad del candidato vacunal pudo
comprobarse una cinética de anticuerpos similar a la observada en este ensayo;(16,19)
coincidente, además, con resultados obtenidos en voluntarios inmunizados con la
misma cepa vacunal.(15)
Por otra parte, la activación de
los ganglios linfáticos mesentéricos y de las placas de Peyer, hallazgos
observados en el análisis histológico, sugiere que estos cambios pudieran ser
parte del mecanismo de respuesta inmunológica a la vacuna.(21)
El estudio de inmunogenicidad y
toxicidad aguda descrito, permitió demostrar que las ratas SD son un biomodelo
relevante para la evaluación de la seguridad preclínica del candidato vacunal
vax-COLER®. La aplicación de una dosis no produjo efectos tóxicos
generales ni locales en las ratas. Es por ello, que el resto de los estudios de
seguridad toxicológica preclínica se realizarán en este biomodelo y con la
dosis propuesta para ser utilizada en humanos.
Conflicto de Intereses
Los autores son investigadores del
Instituto Finlay de Vacunas, centro en el que se desarrolló el candidato
vacunal contra el cólera.
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* Médico Veterinario y Zootecnista,
Master en Medicina Preventiva Veterinaria, Doctor en Ciencias de la Salud. Jefe
del Departamento de Modelos Animales y Toxicología Experimental. Profesor
Adjunto de la Universidad Agraria de la Habana. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8198-9161