ARTÍCULO DE REVISIÓN

M�todos alternativos como parte de las nuevas tendencias en el control de calidad de vacunas

Alternative methods as part of the new trends in vaccine quality control

Mario Landys-Chovel^*

Instituto Finlay de Vacunas. La Habana, Cuba.

email: mlandys@finlay.edu.cu

* M�ster en Farmacolog�a Experimental, Director de Control de Calidad IFV.

RESUMEN

El control de calidad de las vacunas resulta fundamental para las actividades de producci�n, liberaci�n lote a lote y comercializaci�n de las vacunas. Sin embargo, en la actualidad este es un proceso que por su concepci�n es lento y costoso debido a que se apoya en la realizaci�n de extensas pruebas en animales para demostrar la potencia y seguridad de estos productos biol�gicos. El desarrollo de m�todos alternativos inspirados en el principio de las 3Rs (Reducci�n, Refinamiento y Reemplazo) constituye una tendencia que debe impactar de manera muy significativa en la reducci�n de los tiempos de liberaci�n y el costo del proceso de control de calidad de vacunas en los pr�ximos a�os. En particular la sustituci�n de las pruebas de potencia y toxicidad in vivo por procedimientos alternativos m�s relevantes, r�pidos, exactos, reproducibles, robustos y baratos, que incluyen la serolog�a, la cuantificaci�n directa de ant�geno, los ensayos en cultivos celulares y el enfoque a consistencia, por solo mencionar algunos; implica un cambio de paradigma, con indiscutibles repercusiones �ticas, log�sticas, econ�micas y cient�fico-t�cnicas, para el aseguramiento de los par�metros de calidad de los inmunobiol�gicos con el mejor balance costo-beneficio: las vacunas. Los fundamentos t�cnicos de estos m�todos alternativos, sus ventajas y nivel de implementaci�n a nivel internacional, as� como sus principales limitaciones, son abordados en este trabajo.

Palabras clave: M�todos alternativos, control de calidad, pruebas de potencia, toxicidad, vacunas.

ABSTRACT

Vaccine quality control is crucial for the manufacturing, lot release and commercialization activities worldwide. However, the current process is by-design too slow and expensive because is based on large animal assays for assuring the potency and safety of these important biological products. The development of 3Rs alternative methods (Reduction, Refinement and Replacement) is a trend able to significantly reduce the releasing times and costs of the vaccine quality control processes in the next few years. Particularly, the replacement of the animals-based potency and toxicity assays by alternative procedures more relevant, fast, accurate, reproducible and cheap, including serology, direct antigen quantification, cell culture tests and the Consistency Approach, for just mentioning some of them, implies a paradigm shift, with undisputable ethical, logistical, economic, scientific and technical repercussions for ensuring the vaccine quality parameters. Theoretical basements, advantages and implementation levels of the alternatives methods as well as their main limitations are presented in this paper.

Keywords: Alternative methods, quality control, potency assay, toxicity assay, vaccines.

INTRODUCCIÓN

Las vacunas son consideradas las m�s efectivas herramientas para la prevenci�n de enfermedades infecciosas. De hecho, el uso de las vacunas y dem�s inmunobiol�gicos, junto a mejor�as en aspectos de higiene, dieta y alojamiento, tuvo un impacto fundamental en la reducci�n de la mortalidad y la morbilidad de un buen n�mero de enfermedades infecciosas a partir del siglo XIX. En los a�os venideros la importancia de estos productos biol�gicos continuar� increment�ndose, tomando en cuenta, entre otros factores, la necesidad de la erradicaci�n de enfermedades a nivel global, la emergencia de cepas de bacterias resistentes a antibi�ticos y la reemergencia de algunas infecciones virales y bacterianas que se consideraban virtualmente eliminadas (1).

Hasta el momento, y a pesar de los nuevos avances en vacunolog�a, la producci�n de la mayor�a de las vacunas comercializadas a�n se basa en t�cnicas convencionales, que incluyen la atenuaci�n, inactivaci�n o destoxificaci�n de la cepa de microorganismo o toxina para adecuarla a los prop�sitos de la inmunizaci�n. Debido a la complejidad de los procesos de producci�n de vacunas y a la existencia de m�ltiples variables que pueden afectar la calidad del producto resultante, es esencial desarrollar un n�mero significativo de pruebas de control de calidad para garantizar la seguridad y eficacia lote a lote, de modo que se demuestre la inocuidad del producto y su capacidad para inducir protecci�n tras la inmunizaci�n (2).

No obstante, en los �ltimos a�os existe un cambio de paradigma en la estrategia para acometer el control de calidad de las vacunas debido a los siguientes factores:

� La evoluci�n del concepto de control de calidad, dirigido m�s bien a asegurar la consistencia de un producto que ya ha demostrado ser seguro y eficaz.

� El desarrollo de una nueva generaci�n de vacunas y productos biol�gicos bien definidos y caracterizados desde el punto de vista molecular, lo cual reducir�a la necesidad del extenso y costoso control por ensayo que se realiza hoy en d�a.

� La prioridad que se le est� otorgando al desarrollo e implementaci�n de m�todos alternativos a los ensayos cl�sicos en animales (3).

En particular el desarrollo e implementaci�n de los m�todos alternativos se basa en el principio de las 3Rs (Refinamiento, Reducci�n y Reemplazo) y surge como respuesta a un reclamo de la comunidad internacional, en particular en pa�ses desarrollados, que se opon�a al empleo indiscriminado de animales en la experimentaci�n biom�dica (4).

Las principales razones para la oposici�n son de naturaleza �tica, debido al severo dolor y sufrimiento a que son sometidos los animales en muchos ensayos (5), pero tambi�n deben considerarse las razones econ�micas atribuibles al costo por el n�mero de animales utilizados en los ensayos y su mantenimiento especializado, as� como cient�fico-t�cnicas si se toman en cuenta la irrelevancia de algunos ensayos y su elevada variabilidad (6).

Estas limitaciones han impulsado el desarrollo de los m�todos alternativos, los cuales se nutren cada vez m�s del desarrollo cient�fico y tecnol�gico alcanzado por la humanidad en los �ltimos a�os. El objetivo del presente trabajo de revisi�n es ofrecer una panor�mica actualizada acerca de los principales m�todos alternativos en uso o en progreso, como parte de las nuevas tendencias para el control de calidad de vacunas.

1. Ensayos de actividad biol�gica

Ensayos serol�gicos

Los ensayos de actividad biol�gica o potencia, consistentes en la medici�n de uno o m�s par�metros relacionados directa o indirectamente con la eficacia, han sido considerados hasta hoy el pilar fundamental del control de calidad de las vacunas. Su dise�o difiere en funci�n del tipo de vacunas. En el caso de las vacunas vivas atenuadas (Bacilo de Calmette-Guerin o BCG, Polio oral trivalente, Triple viral Papera-Rubeola-Sarampi�n, Fiebre amarilla) la eficacia de cada lote de vacuna est� relacionada con el n�mero de part�culas vivas, las cuales son satisfactoriamente determinadas por conteo o por titulaci�n in vitro (6).

Bien diferente resulta el escenario en el caso de las vacunas inactivadas, para las cuales los ensayos de potencia son desarrollados en especies animales sensibles, por lo general en modelos de reto, es decir, inmunizaci�n de los animales y posteriormente reto con la cepa virulenta para demostrar protecci�n inmunitaria como medida de la eficacia cl�nica. Es por ello que estos ensayos han sido considerados como reglas de oro (�golden standard�) a la hora de estimar la calidad y eficacia de las formulaciones vacunales. Sin embargo, se ha demostrado que, salvo excepciones, la mayor parte de estos ensayos no constituyen verdaderos correlatos de protecci�n cl�nica. Incluso en aquellas vacunas donde tradicionalmente se ha considerado el ensayo de reto como una medida de la eficacia en ni�os (como es el caso de los ensayos de reto para los componentes tet�nico y pertussis), hoy se estima que la correlaci�n entre ambos par�metros es cuando menos cuestionable (6, 7).

Si tomamos en consideraci�n lo anteriormente descrito y sumamos las indiscutibles desventajas de los ensayos de reto en t�rminos t�cnicos (complejidad, riesgos biol�gicos, larga duraci�n, gran variabilidad) y econ�micos, as� como los cuestionamientos �ticos, puede comprenderse el actual esfuerzo por desarrollar e implementar t�cnicas anal�ticas m�s adecuadas, r�pidas, �ticas y relevantes en el prop�sito de asegurar la consistencia lote a lote de las producciones de vacunas. Una de las principales tendencias se basa en la sustituci�n de las pruebas de reto por ensayos serol�gicos, apoyados en la relevancia de los anticuerpos para la inmunidad inducida por vacunas y las ventajas de las metodolog�as in vitro disponibles en la actualidad para cuantificar anticuerpos.

Los ensayos serol�gicos excluyen el uso de microorganismos virulentos o toxinas, por lo que resultan pruebas de mayor seguridad; eliminan de forma autom�tica el reto y por tanto disminuyen significativamente los niveles de estr�s y dolor en los animales de ensayo; el n�mero de animales empleado disminuye a partir de su menor variabilidad intr�nseca (intervalos de confianza menores) y por la sustituci�n de los animales utilizados en la fase de reto por procedimientos in vitro de cuantificaci�n de anticuerpos (ELISA, titulaci�n en cultivos celulares, hemaglutinaci�n), m�s r�pidos, exactos, precisos y robustos; el tiempo de ejecuci�n de los ensayos se acorta a partir de la disponibilidad de un punto final de ensayo cuantitativo y m�s temprano respecto a la aparici�n de signos cl�nicos indicativos de la enfermedad o la muerte (6).

Dentro de los ensayos serol�gicos internacionalmente aceptados como alternativas a los tradicionales ensayos de reto est�n los desarrollados para los componentes tet�nico, dift�rico, pertussis, antirr�bico y antileptospir�sico. Estos ensayos pueden ser multi-diluci�n, simulando el mismo dise�o de la etapa de antigenicidad de los ensayos de reto, pero la actual tendencia es la introducci�n paulatina de ensayos serol�gicos de diluci�n �nica, tanto para la vacuna de referencia como para los lotes de vacunas objeto de evaluaci�n. En cuanto a los m�todos in vitro para la cuantificaci�n de anticuerpos, los ELISA son las t�cnicas de elecci�n, tanto los que emplean como sustancias de recubrimiento las subunidades de vacunas (t�tano, difteria, pertussis acelular, rabia), como los que utilizan c�lulas enteras (pertussis, leptospira). No obstante, otros procedimientos como la titulaci�n en cultivos celulares (por ejemplo, c�lulas VERO para el componente dift�rico) son igualmente empleados (8-10).

La serolog�a tiene como ventajas adicionales, por una parte, la posibilidad de almacenar el material de ensayo (sueros) por un per�odo prolongado, a fin de dar respuesta a situaciones derivadas de la vigilancia postcomercializaci�n o ante demandas reguladoras, y por otra la eficiencia que puede lograrse a partir de la combinaci�n de la prueba para varios ant�genos (formulaci�n de vacuna combinada), lo cual igualmente impacta en el n�mero global de animales empleados en las pruebas (11). Recientemente se han propuesto sistemas como el Multiplex que permite la cuantificaci�n simult�nea de los t�tulos de anticuerpos generados por la inmunizaci�n de varios ant�genos vacunales (12).

Los ensayos serol�gicos tambi�n han sido evaluados como m�todos alternativos a las pruebas de seroneutralizaci�n in vivo, desarrolladas por el Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (NIH) y adoptadas por la Agencia de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (Food and Drug Administration, FDA), en tanto han sido ampliamente implementadas por los pa�ses de Latinoam�rica para controlar la potencia de vacunas de toxoides tet�nico y dift�rico. Si bien el dise�o y el enfoque de estas pruebas difiere notablemente de las pruebas de reto aprobadas por la Organizaci�n Mundial de la Salud y la Farmacopea Europea, la tendencia ha sido igualmente la adopci�n de metodolog�as in vitro (ELISA, titulaci�n en c�lulas VERO) en lugar de la etapa final de los ensayos de seroneutralizaci�n in vivo, en las cuales se mezclan diluciones de sueros (conteniendo anticuerpos derivados de la inmunizaci�n con vacuna) con toxina para retar a los animales con vistas a demostrar protecci�n (13-15).

Aunque la serolog�a constituye una reconocida, generalizada y v�lida alternativa a las pruebas de reto, deben considerarse igualmente algunas desventajas. Por ejemplo, si bien el ELISA posee numerosas ventajas t�cnicas como: su relativa facilidad de ejecuci�n, la disponibilidad de reactivos comerciales, su elevada especificidad, su adecuado desempe�o en t�rminos de exactitud, precisi�n y robustez, en este tipo de ensayo se suele sobreestimar la concentraci�n de anticuerpos en el suero. Ello se debe a que en su calidad de ensayo de uni�n, los anticuerpos de baja afinidad, producidos durante los primeros d�as de inmunizaci�n, se unen a la fase s�lida del ensayo y por tanto son cuantificados, en tanto las pruebas de reto solamente miden los anticuerpos funcionales o neutralizantes. Esta limitante no posee mayor relevancia, siempre y cuando exista una adecuada correlaci�n entre el ensayo serol�gico (ELISA) y la prueba de reto y ambos m�todos sean capaces de discriminar de forma equivalente entre lotes de diferente actividad biol�gica, incluyendo muestras subpotentes (6, 16).

Otros cuestionamientos relativos al empleo de sueros hiperinmunes como: curvas de calibraci�n obtenidos por esquemas de inmunizaci�n diferentes a los sueros objeto de ensayo, con la consiguiente diferencia en la avidez y afinidad de anticuerpos e impacto potencial en el paralelismo de las respuestas, el empleo de un n�mero a�n significativo de animales en el caso de algunos ensayos serol�gicos (en particular las pruebas multi-diluci�n) y la no relevancia biol�gica de la cuantificaci�n de anticuerpos en relaci�n con la protecci�n han sido reportados (13, 17).

No obstante, el valor de los ensayos serol�gicos como naturales sustitutos de las pruebas de reto en animales, bien sea solos o complementados por otros ensayos, es incuestionable.

Ensayos de cuantificaci�n de ant�geno

Para algunas vacunas inactivadas la tendencia ha sido la introducci�n de ensayos de cuantificaci�n de ant�geno en lugar de las pruebas de actividad biol�gica en animales. Estos m�todos son inmunoensayos in vitro que se basan generalmente en la uni�n de ant�genos protectores claves, presentes en las muestras de vacunas, a sus anticuerpos espec�ficos. Uno de los m�todos representativos de esta tendencia lo constituy� el ensayo de potencia in vitro para el ant�geno de superficie de la vacuna anti-hepatitis B recombinante, que sustituy� la prueba de inmunogenicidad en ratones.

En su momento coexistieron dos tipos de inmunoensayos, el de cuantificaci�n directa de ant�geno, tipificado por el uso de los estuches comerciales de las compa��as Abbott y Murex, y uno basado en la neutralizaci�n previa del ant�geno con inmunoglobulina anti-hepatitis B y la posterior cuantificaci�n de los anticuerpos remanentes como una medida indirecta de la concentraci�n de ant�geno (18-19).

Un enfoque similar fue implementado para la vacuna antirr�bica, como una alternativa al ensayo de reto conocido por ensayo NIH. En este caso se trat� de un ELISA desarrollado con anticuerpos monoclonales dirigidos a glicoprote�nas y nucleoprote�nas del virus de la rabia presentes en la vacuna (20).

Si bien este ha sido un ensayo que logr� incluirse en la Farmacopea Europea para liberaci�n de lotes de esta vacuna, todav�a en la pr�ctica se contin�a haciendo la prueba NIH. Lo anterior se debe a que en la mayor parte de los estudios de validaci�n ha existido una pobre correlaci�n entre ambos ensayos, lo cual parece deberse m�s a la elevada variabilidad de la prueba NIH que a problemas de desempe�o del inmunoensayo (21).

Este mismo tipo de ensayo (ELISA con empleo de anticuerpos monoclonales) ha sido satisfactoriamente evaluado para vacunas antileptospir�sicas veterinarias (22).

Otro de los ejemplos de inmunoensayos utilizados como una medida de la actividad biol�gica de vacunas inactivadas es la prueba de inmunodifusi�n radial para las vacunas de influenza. La principal limitante en relaci�n con la adopci�n de este tipo de ensayos como una medida de la potencia es que la mayor parte de las vacunas inactivadas contienen un adyuvante, el cual tiene que ser eliminado previo a la cuantificaci�n antig�nica. Este proceso tiene que ser eficiente en t�rminos de recobrado del ant�geno y retenci�n de su integridad, lo que no siempre resulta alcanzable (6).

Otra de las limitantes lo constituye la no disponibilidad de anticuerpos monoclonales comerciales y el costo relativamente alto de su producci�n.

Ensayos inmunol�gicos in vitro en las fases de Investigaci�n-Desarrollo y evaluaci�n precl�nica

Si bien los ensayos de potencia utilizados en el control de calidad pueden ser reemplazados por m�todos alternativos, hasta el momento no resulta aceptable hacer lo mismo en las fases de Investigaci�n-Desarrollo y evaluaci�n precl�nica del ciclo de producci�n de las vacunas, en las cuales es obligatorio el empleo de ensayos funcionales in vivo bajo el esquema inmunizaci�n-reto (siempre que estos existan) para demostrar el papel de las estructuras antig�nicas en la protecci�n, as� como las interacciones entre los componentes de las vacunas. Sin embargo, en los �ltimos a�os se ha incrementado la contribuci�n de modelos in vitro para el pesquisaje en estudios de desarrollo de vacunas, enfocados en aspectos particulares de la respuesta inmune como el rol de de las c�lulas presentadoras de ant�geno (CPA) en las respuestas de anticuerpos o la potencial relevancia de algunos ant�genos para la inmunogenicidad (23).

Entre los modelos de inmunogenicidad disponibles se encuentran los que se basan en los cultivos simples de c�lulas mononucleares sangu�neas perif�ricas y los m�s complejos consistentes en sistemas de co-cultivos de varios tipos de c�lulas inmunes (CPA, linfocitos B y T, c�lulas �Natural Killer� y c�lulas B de memoria y T) y accesorias (fibroblastos y c�lulas endoteliales), adem�s de citoquinas y otros factores necesarios para la comunicaci�n intercelular (20, 24). Recientemente, un complejo sistema in vitro (MIMICTM) fue introducido en el mercado por la compa��a VaxDesign. Este sistema est� compuesto por 3 m�dulos integrados: un modelo tisular perif�rico, un modelo tisular linfoide y un modelo de enfermedad, representando cada uno un elemento funcional del sistema inmune (25).

Si bien se ha reportado una buena correlaci�n entre la calidad de la vacuna y los perfiles de citoquinas tras la estimulaci�n de c�lulas mononucleares sangu�neas perif�ricas con toxoide tet�nico, y a pesar de lo prometedor que resulta la tecnolog�a MIMIC, los modelos de inmunogenicidad in vitro a�n deben mostrar su relevancia en la investigaci�n y evaluaci�n de vacunas, siendo su aporte al control de calidad a�n poco significativo.

2. Ensayos de seguridad

La seguridad constituye uno de los requisitos fundamentales de las vacunas. De hecho, muchos la consideran el requerimiento fundamental a partir del hecho de que los beneficios de las vacunas s�lo pueden apreciarse a mediano y largo plazo, en cambio la aparici�n de eventos adversos son percibidos de inmediato, lo cual tiene un impacto negativo directo y considerable para la aceptaci�n de las vacunas por la poblaci�n. Es por ello que la seguridad debe mantenerse a trav�s de procesos de producci�n consistentes, ensayos de seguridad rigurosos y la vigilancia post-comercializaci�n. Si bien los ensayos en animales han resultado determinantes en la demostraci�n de la seguridad de las vacunas, nuevas alternativas han sido desarrollados sobre la base del principio de la 3Rs y la irrelevancia t�cnica de algunas de estas pruebas.

Ensayo de Inocuidad o Seguridad general

El ensayo de Inocuidad o Seguridad general es desarrollado para detectar contaminantes inesperados. Se basa en la inmunizaci�n de 5 ratones y dos curieles con al menos una dosis humana y la observaci�n de los mismos para la detecci�n de alguna se�al de enfermedad. Sin embargo, este ensayo ha demostrado su escaso valor predictivo a partir del peque�o n�mero de animales utilizado, lo cual hace improbable la detecci�n de contaminaci�n. Es por ello que la tendencia actual en la �ltima d�cada ha sido emplearlo en la etapa de control de los graneles de vacunas en lugar del producto terminado. Por su parte, la Farmacopea Europea ha eliminado este ensayo de las monograf�as de vacunas que cuentan con un ensayo de toxicidad espec�fica, manteni�ndolo solamente para vacunas que no disponen de tal ensayo, como es el caso de las vacunas contra el C�lera, la Fiebre Tifoidea, el Haemophilus influenzae tipo b y la Influenza, as� como las de polisac�ridos pneumoc�ccicos y meningoc�ccicos. Esta decisi�n se basa igualmente en un an�lisis de riesgo, pues si los fabricantes cumplen adecuadamente con los requisitos de las Buenas Pr�cticas de Producci�n y garantizan la consistencia de sus fabricaciones, el riesgo de contaminaci�n t�xica es extremadamente bajo (26-27).

Algunos fabricantes han propuesto modificaciones del ensayo de Seguridad General que incluyen la introducci�n de curvas de incremento de peso espec�ficas de vacunas y datos histopatol�gicos (28), pero los cuerpos reguladores internacionales (incluyendo la OMS) ya reconocen la pobre sensibilidad e irrelevancia t�cnica del ensayo, unido a los progresos en el cumplimiento de BPF a nivel global y la existencia de otros m�todos de control que brindan informaci�n m�s confiable sobre la inocuidad de los productos, sugiriendo entonces su eliminaci�n como ensayo de control de calidad de vacunas (29).

Ensayos de toxicidad espec�fica y Reversi�n a la toxicidad

Los ensayos de toxicidad espec�fica y reversi�n a la toxicidad se dise�an fundamentalmente para vacunas bacterianas inactivadas como un chequeo final del proceso de inactivaci�n. Este es un ensayo que en funci�n del tipo de vacuna se realiza en curieles o ratones, en funci�n de la sensibilidad de la especie a la exotoxina en cuesti�n. En la actualidad existen m�todos alternativos de una gran sensibilidad para la detecci�n de toxicidad residual en vacunas. Uno de los m�s implementados es el ensayo en c�lulas Vero, el cual es muy sensible para toxina dift�rica y por lo tanto ideal para detectar cantidades m�nimas de toxina residual en toxoides purificados. Es por ello que este ensayo es uno de los m�todos alternativos validados internacionalmente reconocidos como un sustituto de la prueba de toxicidad espec�fica en curieles, ya sea por el m�todo subcut�neo o intrad�rmico. Otro de los ensayos en cultivos celulares que se ha empleado como m�todo alternativo de manera satisfactoria es el ensayo en c�lulas CHO para sustituir la prueba de ganancia en peso para componente pertussis (30).

Si bien ambos ensayos en cultivos de c�lulas poseen mayor sensibilidad que las pruebas en animales, deben considerarse algunas limitantes como la interferencia del adyuvante y la toxicidad no espec�fica provocada por algunos excipientes como el tiomersal y el formaldeh�do residual. Por otra parte, la log�stica asociada a los laboratorios de cultivos de c�lulas encarece las determinaciones, requiri�ndose adem�s de personal bien entrenado en este tipo de actividad t�cnica. No obstante, su efectiva implementaci�n contribuye a la reducci�n de animales durante los controles de ingredientes farmac�uticos activos y graneles de vacunas. Otra de las nuevas tendencias son los ensayos de medici�n de la actividad enzim�tica de las toxinas mediante reacciones bioqu�micas que involucran p�ptidos sint�ticos flourescentes, los cuales mimetizan los sustratos naturales que utilizan las toxinas.

Los productos de degradaci�n son cuantificados por cromatograf�a l�quida de alta resoluci�n (HPLC) con detecci�n fluorescente. Estos m�todos han mostrado una elevada especificidad y sensibilidad para toxinas tet�nica y pertussis, sin embargo a�n deben desarrollarse estudios de validaci�n que aseguren su capacidad para sustituir las pruebas de toxicidad cl�sicas (31). Otro m�todo en progreso lo constituye el denominado BINACLE test (ensayo de uni�n y ruptura, por sus siglas en ingl�s), el cual es espec�fico para detectar niveles residuales de la neurotoxina tet�nica a partir de la combinaci�n en un mismo modelo de la capacidad de uni�n de la holotoxina a su receptor (principalmente gangli�sido GT1b) con su acci�n enzim�tica, que se produce al reducirse y activarse las cadenas L que a su vez ocasionan la ruptura de la sinaptobrevina. La cuantificaci�n de los fragmentos de esta mol�cula es directamente proporcional a la inhibici�n del neurotransmisor en las motoneuronas (32).

Ensayos de neurovirulencia

Los ensayos de neurovirulencia son desarrollados para verificar la no reversi�n a la virulencia de las vacunas vivas atenuadas, ensayos que son realizados en monos, y que han demandado el desarrollo de alternativas por razones �ticas, pero tambi�n por el limitado poder discriminativo de estas pruebas. El desarrollo de cepas de rat�n transg�nicas, capaces de expresar el receptor de poliovirus humano, ha permitido que sea posible reproducir en estos ratones los mismos signos cl�nicos y lesiones en el Sistema Nervioso Central que inducen los serotipos de poliovirus en los monos.

Por otra parte, la detecci�n y cuantificaci�n de mutaciones en el genoma constituyen la base de un m�todo in vitro para este prop�sito, que parte del principio de que la reversi�n a la virulencia es el resultado de mutaciones menores en el genoma. Este m�todo se denomina: an�lisis de mutantes por Reacci�n en cadena de la Polimerasa (PCR) y fragmentaci�n por enzimas de restricci�n (MAPREC, por sus siglas en ingl�s), el cual consta de las siguientes etapas: extracci�n del ARN de la vacuna, transcripci�n inversa y amplificaci�n del ADNc por PCR, fragmentaci�n utilizando enzimas de restricci�n y separaci�n de los fragmentos y cuantificaci�n de las bandas en gel.

El MAPREC ha mostrado una buena correlaci�n con la neurovirulencia inducida en monos por poliovirus tipo 3, aunque resulta menos evidente la correlaci�n para los serotipos 1 y 2. Enfoques moleculares similares se encuentran en desarrollo en estos momentos para las vacunas de Sarampi�n y Fiebre amarilla (33).

Ensayos para pir�genos

La evaluaci�n de la presencia de pir�genos, grupo heterog�neo de sustancias que inducen fiebre en el humano, se desarrolla tradicionalmente en un modelo animal, mediante el monitoreo de la temperatura corporal en 3 conejos durante 3 horas tras la administraci�n del producto. Este ensayo no constituye un requerimiento para todas las vacunas, en cambio es obligatorio para las vacunas de polisac�ridos, antirr�bica y contra la encefalitis.

El apego al principio de las 3Rs y ciertas inconsistencias del ensayo de pir�genos llevaron al desarrollo de metodolog�as in vitro, entre ellas el conocido ensayo del Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL), el cual se basa en la coagulaci�n iniciada por endotoxina del lisado preparado a partir de la hemolinfa del llamado cangrejo herradura (Limulus polyphenus).

La sensibilidad del LAL es superior a la del ensayo en conejos, lo cual contribuy� a su r�pida aceptaci�n en monograf�as de vacunas como las de hepatitis A, Haemophilus influenzae tipo b, influenza, antirr�bica, antitifo�dica y antiamar�lica. No obstante, el LAL no es un ensayo in vitro en toda su extensi�n, pues aunque su ejecuci�n se realiza sin el empleo de animales, se requieren de grandes cantidades del crust�ceo Limulus polyphenus y otros para satisfacer las demandas de hemolinfa para los juegos de reactivos de LAL.

Por otra parte, es un ensayo que suele dar falsos positivos, ya que algunos componentes de las formulaciones de vacunas suelen ser interferentes. Su principal limitaci�n radica en que aunque es muy espec�fico para lipopolisac�ridos, o sea, endotoxinas derivadas de bacterias Gram negativas, no es capaz de detectar otros tipos de pir�genos derivados de bacterias Gram positivas y hongos (34).

En la �ltima d�cada un nuevo ensayo basado en sangre humana ha ido ganando espacio. Su fundamento te�rico reside en la liberaci�n de mediadores (IL-1-Β, IL-6, TNFα) por parte de los monocitos y macr�fagos contenidos en la sangre humana cuando estos interact�an con los pir�genos.

Se conoce que estos mediadores son liberados de forma end�gena ante la presencia de sustancias pirog�nicas, siendo responsables del incremento de la temperatura corporal en el humano por acci�n sobre el hipot�lamo, por lo que su medici�n por ELISA constituir�a un eficiente indicador de la presencia de pir�genos en los productos evaluados. Entre sus ventajas se cuenta la no restricci�n a las endotoxinas, permitiendo la evaluaci�n de un mucho m�s amplio espectro de sustancias pirog�nicas, si bien su sensibilidad no supera la del LAL. Como m�todo ha sido reconocido en la Farmacopea Europea como un sustituto del ensayo de pir�genos en conejos y se perfila con un gran potencial para la evaluaci�n de pir�genos en productos bioterap�uticos de nueva generaci�n. Por otra parte, se le ha se�alado como una limitaci�n log�stica la necesidad de sangre fresca para la realizaci�n del m�todo, pues tras un per�odo de almacenamiento de la sangre por 8 horas a temperatura ambiente, se produce una liberaci�n espont�nea de IL-1-Β. No obstante, el m�todo ha resultado ser viable y eficaz empleando sangre crioconservada. Igualmente el ensayo suele realizarse en cultivos de l�neas de monocitos/macr�fagos (35).

3. El Enfoque a Consistencia para liberaci�n de lotes

Este enfoque se basa en el actual principio fundamental de la fabricaci�n de vacunas: la producci�n consistente de lotes de vacuna con caracter�sticas similares a los lotes que han demostrado ser seguros y eficaces en las especies diana.

Para algunos productos como es el caso de las vacunas convencionales de polisac�ridos, as� como las conjugadas, la evaluaci�n de la consistencia ha derivado en la simplificaci�n de los protocolos de liberaci�n de lotes, a partir de que la inmunogenicidad de dichas vacunas es significativamente proporcional a su tama�o molecular. Por tanto, la estimaci�n de la potencia se basa fundamentalmente en la caracterizaci�n f�sico-qu�mica en t�rminos de composici�n, tama�o molecular y contenido antig�nico.

En la actualidad se considera que la anterior tendencia es extrapolable a las vacunas tradicionales, por lo que los ensayos de liberaci�n de lotes deben reflejar el nivel de consistencia en la producci�n alcanzado por la vacuna. De esta manera, el Enfoque de Consistencia implica el uso de un grupo de par�metros que definan un perfil del producto (contenido antig�nico, integridad, pureza), capaz de sustituir los ensayos de liberaci�n. Dicho perfil debe asegurar que cada lote liberado sea similar a lotes de vacunas producidos por el fabricante que hayan probado su eficacia y seguridad, seg�n las caracter�sticas acordadas entre el fabricante y el regulador tras el registro del producto (36).

De igual manera, otros elementos como son la cuidadosa validaci�n y mantenimiento de los procesos de producci�n y la historia de campo de la vacuna (estudios pre-registro y datos de vigilancia postcomercializaci�n) pueden resultar muy valiosos en la aplicaci�n de este enfoque.

Si bien la aplicaci�n del Enfoque a Consistencia resultar�a verdaderamente revolucionario en cuanto a romper con el actual paradigma del extenso y costoso control de calidad para la liberaci�n de lotes de vacunas, as� como eliminar o reducir muy significativamente el empleo de animales en los ensayos de potencia y toxicidad que conforman las especificaciones actuales de estos productos, a�n no ha resultado posible su extensi�n m�s all� de exitosas pruebas demostrativas para algunas vacunas.

Entre los obst�culos principales est� el hecho de que muchas vacunas no son biol�gicos bien caracterizados, por lo que elementos estructurales como la conformaci�n antig�nica y otros vinculados al adyuvante y el grado de asociaci�n de este con el ant�geno deben ser cuidadosamente monitoreados, brindando argumentos para el mantenimiento de las pruebas de potencia en animales. Sin embargo, la combinaci�n de ensayos exactos de cuantificaci�n de ant�genos en los graneles (que incluye una bater�a de m�todos f�sico-qu�micos de avanzada como la espectrometr�a de masa, el an�lisis por biosensor, el dicro�smo circular, la espectroscop�a de fluorescencia, la resonancia magn�tico nuclear, la microscop�a electr�nica, entre otras), el uso de m�todos de producci�n consistentes (monitoreados por controles de proceso adecuados) y ensayos de control de calidad in vitro podr�an predecir y garantizar la potencia del producto final sin necesidad de la realizaci�n del ensayo de potencia in vivo (37-38).

CONCLUSIONES

La incorporaci�n de m�todos alternativos al control de calidad rutinario de vacunas posee gran impacto sobre la din�mica de los procesos de producci�n, liberaci�n de lotes y comercializaci�n de las vacunas, adem�s de aportar significativas ventajas respecto a los procedimientos de control vigentes. Con los progresos alcanzados hasta hoy se requiere el consenso y el esfuerzo conjunto de investigadores, productores y reguladores en actividades de validaci�n y puesta a prueba de dichos m�todos a fin de garantizar su adecuada y completa implementaci�n.

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Recibido: Agosto de 2018              Aceptado: Septiembre de 2018