ARTÍCULO ORIGINAL

Activaci�n del polisac�rido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 23F para la obtenci�n de vacunas conjugadas

Activation of the capsular polysaccharide serotype 23F of Streptococcus pneumoniae to obtain conjugate vaccine

Janoi Chang-Calder�n^*, Yohanna Serrano-Rodr�guez,^** Raine Garrido-Arteaga, Jessy Pedroso-Fern�ndez, F�lix Cardoso-San Jorge, Laura Rodr�guez-Noda, Darielys Santana-Mederos, Dagmar Garc�a-Rivero, Yury Vald�s-Balb�n, Vicente V�rez-Bencomo

Instituto Finlay de Vacunas. Ave. 27 No. 19805, La Lisa, La Habana, Cuba.

email: yserrano@finlay.edu.cu

* Doctor en Ciencias, Investigador Agregado.

** Maestra en Ciencias, Investigadora Agregada.

RESUMEN

En la actualidad, las vacunas conjugadas constituyen un gran hito en el desarrollo de f�rmacos que protegen contra las enfermedades infecciosas. Estas vacunas no solo disminuyen dr�sticamente la mortalidad y morbilidad de diferentes enfermedades causadas por bacterias en la poblaci�n infantil; sino que tambi�n repercuten sobre la poblaci�n no vacunada. Las vacunas conjugadas se basan en establecer una uni�n covalente entre un polisac�rido y una prote�na portadora para lo cual existen diferentes procedimientos qu�micos. Todos los procedimientos de conjugaci�n requieren la presencia de grupos reactivos complementarios que muchas veces son generados en ambas macromol�culas. Este trabajo se enfoca en el estudio de la reacci�n de fragmentaci�n y de la oxidaci�n pery�dica sobre el polisac�rido capsular serotipo 23F de Streptococcus pneumoniae para su uso como ant�geno vacunal. Se estableci� la fragmentaci�n del polisac�rido mediante hidr�lisis con �cido ac�tico y trifluoro�cetico. En el caso de la reacci�n de oxidaci�n se encontr� que la cantidad de moles de peryodato de sodio y la temperatura influyen de manera directamente proporcional sobre la generaci�n de grupos carbonilos. Adicionalmente se demostr� que el sustituyente glicerol-fosfatos presente en la estructura del serotipo 23F es relevante para conservar la antigenicidad. El procedimiento descrito permite obtener conjugados inmunog�nicos a partir del polisac�rido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 23F en el modelo de conejos.

Palabras clave: Streptococcus pneumoniae, vacunas conjugadas, hidrolisis �cida, oxidaci�n pery�dica.

ABSTRACT

Nowadays conjugate vaccines are a major milestone in the development of drugs against infectious diseases. These vaccines drastically reduce mortality and morbidity from different diseases caused by bacteria in children; but also impact on non-vaccinated population. Conjugate vaccines are based on a covalent bond between a polysaccharide and a carrier protein for which there are different chemical procedures. All conjugate procedures require the presence of additional reactive groups that often are generated in both macromolecules. This work focus on the study of the fragmentation reaction and peryodic oxidation on the capsular polysaccharide serotype 23F Streptococcus pneumoniae for use as a vaccine antigen. It was possible to establish the fragmentation reaction of the polysaccharide by hydrolysis with acetic and trifluoroacetic acid. Directly proportional ratio was found between numbers of moles of sodium periodate and temperature on the oxidation reactions. In addition the glycerol-phosphate substituent was found as important motif to preserve the antigenicity. The procedure allows immunogenic conjugate from capsular polysaccharide serotype 23F of Streptococcus pneumoniae in rabbit models.

Keywords: Streptococcus pneumoniae, conjugate vaccines, peryodic oxidation, acid hydrolysis.

INTRODUCCIÓN

Actualmente las infecciones causadas por Streptococcus pneumoniae tienen un gran impacto sobre la morbilidad y mortalidad infantil, problem�tica que es enfrentada con gran efectividad mediante la introducci�n de las vacunas conjugadas (1,2). El �xito de estas vacunas se sustenta en lograr que el sistema inmune inmaduro de los ni�os menores de 5 a�os responda ante los polisac�ridos (Ps), ant�genos T-independientes, como si fueran ant�genos T-dependiente. Esto se logra al establecer un enlace covalente entre el polisac�rido bacteriano y una prote�na portadora (ant�genos T-dependientes).

Existen diversos m�todos qu�micos que describen la formaci�n de esta uni�n covalente entre ambas macromol�culas, pero en todos los casos es necesario la presencia de grupos reactivos complementarios (3-5). Las prote�nas al estar formadas por amino�cidos presentan una gran diversidad de grupos reactivos como: grupos aminos, �cidos carboxilos, tioles, guanidinio, entre otros. Los polisac�ridos, por otro lado, presentan menor diversidad de grupos reactivos que la presentada en las prote�nas. Debido a esto, en muchos casos se introduce una etapa para la activaci�n de los polisac�ridos en los procedimientos de conjugaci�n. Esta etapa de transformaci�n qu�mica tiene por objetivo generar grupos m�s reactivos en el Ps.

Una de estas reacciones es la disminuci�n de la talla molecular que permite el uso de los extremos reductores para luego introducir un brazo espaciador (6). Adicionalmente, la disminuci�n de la talla tambi�n brinda ventajas tecnol�gicas en el trabajo con los Ps como son: un producto con distribuci�n de talla mejor definida, evitar los problemas de solubilidad y viscosidad de los polisac�ridos capsulares nativos, y facilitar los procesos de purificaci�n del producto final (7,8). La oxidaci�n con peryodato de sodio es un procedimiento muy utilizado para la activaci�n de los polisac�ridos. En esta reacci�n se forman grupos aldeh�dos, mediante la oxidaci�n de dos grupos hidroxilos vecinales que son los m�s abundantes en los polisac�ridos capsulares (PsC), con la consiguiente ruptura del enlace carbono-carbono. Los polisac�ridos capsulares est�n formados por unidades repetitivas que pueden contener uno o varios monosac�ridos y adem�s pueden presentar ramificaciones (9).

La reactividad frente a la oxidaci�n con peryodato en los polisac�ridos es primeramente sobre los alcoholes primarios, luego los hidroxilos vecinales en configuraci�n cis y como �ltimo los dioles de configuraci�n trans. Esta susceptibilidad es independientemente a la ubicaci�n de estos en la estructura del polisac�rido, como parte de una ramificaci�n o dentro de la cadena lineal (10). Por ello, el uso de este procedimiento para la obtenci�n de ant�genos vacunales requiere de un control de las condiciones de la reacci�n para evitar afectaciones significativas de la estructura de los polisac�ridos y con ello la p�rdida de informaci�n inmunol�gica del polisac�rido. El presente trabajo tiene como objetivo establecer un procedimiento para la obtenci�n de polisac�ridos fragmentados y activados con grupos aldeh�dos a partir del polisac�rido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 23F. El procedimiento se enfoca en el estudio de la reacci�n de disminuci�n de la talla molecular del polisac�rido capsular mediante la hidr�lisis �cida y la formaci�n de grupos aldeh�dos mediante la oxidaci�n con peryodato de sodio sin afectar la antigenicidad del Ps.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales: La prote�na toxoide tet�nico (TT) lote 6017 suministrada por el Instituto Finlay de Vacunas se obtiene como ingrediente farmac�utico activo en el proceso productivo de la vacuna triple bacteriana DPT�. En el caso del PsC 23F lote 8001, se obtuvo en el Departamento de Desarrollo Farmac�utico del Instituto, cumpliendo con los requisitos recomendados por la Organizaci�n Mundial de la Salud (OMS) para la producci�n de vacunas (11).

Se utilizaron materiales de referencia como el PsC 23F purificado proveniente de la American Type Culture Collection (ATCC) y el suero est�ndar internacional generado en conejos, espec�fico contra el serogrupo 23 (23A, 23B y 23F), suministrado por Statens Serum Institute, Copenhagen.

T�cnicas anal�ticas: La cuantificaci�n de Ps para determinar los rendimientos de las reacciones se realiz� mediante la t�cnica descrita por Br�ckner (12) y los grupos carbonilos generados se determinaron a trav�s del m�todo informado por Porro y cols. (13). En el caso del contenido de prote�na en los conjugados se emple� la t�cnica de cuantificaci�n de prote�nas en disoluci�n, descrita por Lowry y cols. (14).

La evaluaci�n de la identidad de los PsC se realiz� mediante la resonancia magn�tica nuclear prot�nica (RMN ¹H) en un equipo espectr�metro Bruker/Avance DPX 250. El procesamiento de la ca�da libre de inducci�n se realiz� a trav�s del software MestReNova. Las muestras se prepararon tomando entre 5-10 mg del producto seco y se disolvieron en 0,6 mL de agua deuterada (D₂O, Merck >99.8 %) y se secaron en una liofilizadora (Christ Beta 1-8 LD). Este procedimiento se realiz� dos veces antes de disolverlo en agua deuterada para adquirir el espectro, los cuales se adquirieron a una temperatura de 52 �C. La determinaci�n de la constante de distribuci�n de la talla molecular (K_D) se realiz� por cromatograf�a l�quida de alta resoluci�n en columna de exclusi�n molecular TSK 5000 PW con NaCl 0,9 % como fase m�vil y detecci�n por �ndice de refracci�n para el PsC, polisac�rido fragmentado (PsFg-23F) y el polisac�rido oxidado (PsOX-23F) o detecci�n ultravioleta (206 nm) para los conjugados (23F-TT). El an�lisis de los datos se realiz� a trav�s del software ClarityChrom.

Preparaci�n y caracterizaci�n de los polisac�ridos y conjugados de 23F

Disminuci�n de la talla molecular del PsC 23F: A una disoluci�n que contiene 10 mg de PsC 23F en 2 mL de agua destilada, se le adicion� igual volumen de la disoluci�n del �cido en estudio, �cido ac�tico (HAc) o �cido trifluoroac�tico (TFA), al doble de la concentraci�n definida. La mezcla se mantuvo con agitaci�n a 70 �C entre 1�3 h. Transcurrido este tiempo la reacci�n se neutraliz� utilizando una disoluci�n de hidr�xido de sodio 0,1 M y la mezcla se purific� por membranas de celulosa regenerada de 30, 10 y 1 kDa de porosidad. La eficiencia de la reacci�n se determin� de acuerdo al contenido de carbohidrato recobrado en las fracciones 10-30 kDa.

Oxidación con peryodato de sodio del PsFg-23F: Se preparó una disolución de Ps fragmentado en disolución tampón fosfato salina pH 7,0 de manera que se obtuvo una concentración de Ps de 4, 10 o 20 mg/mL, según lo definido en la aleatorización del diseño experimental. Luego, se adicionó igual volumen de disolución de NaIO₄ que contiene los moles equivalentes establecidos en el diseño. La mezcla de reacción se mantuvo con agitación moderada, protegida de la luz a la temperatura correspondiente. Transcurridas las 3 horas de reacción se añadieron dos equivalentes de glicerol por mol de NaIO₄ adicionado. Se conservaron las condiciones de reacción durante 30 min. La mezcla de reacción se purificó mediante ultrafiltración a través de membrana de celulosa regenerada de tamaño de poro 10 kDa.

Conjugación del PsOx-23F a TT mediante aminación–reductiva: La reacción de conjugación se realizó según el procedimiento descrito (15). Solamente se modificó la relación de masa de Ps y proteína que resultó de 1:1 y la concentración de la reacción fue de 10 mg/mL.

Evaluación de la inmunogenicidad: El protocolo en animales, estuvo sujeto al cumplimiento de las normas éticas en la experimentación animal y se aprobó por el Comité de Ética y el Departamento de Calidad de la institución. Se utilizaron conejos blancos de Nueva Zelanda, hembras, de 1,5-1,8 kg de peso (10-12 semanas de edad), procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Se crearon grupos de 5 animales que se inmunizaron con una dosis de 5 μg de Ps contenido en el conjugado o 25 μg de PsC 23F. Además, se incluyó un grupo control al que se le administró suero fisiológico. Las inmunizaciones se realizaron a los 0, 14 y 28 días por vía subcutánea y las extracciones de sangre se realizaron 7 días después de cada inmunización.

Evaluación de memoria inmunológica: A los 120 días, cuando la respuesta de IgG contra el PsC 23F disminuyó, se aplicó una dosis de refuerzo de 25 μg de PsC 23F. Se evaluó la inducción de IgG siete días posteriores a la inmunización. Todos los sueros obtenidos se conservaron a -20 °C hasta su evaluación.

Evaluación del título de IgG contra el PsC 23F: Para evaluar la respuesta de anticuerpos contra el PsC 23F, se siguió un ELISA similar al recomendado por la OMS (16) aunque no fue posible utilizar el sistema de detección por fosfatasa alcalina, sustituyéndose por un conjugado anti conejo-IgG-HRP. Los pasos del ELISA se detallan a continuación: a las placas de 96 pocillos de poliestireno (Maxisorp) recubiertas con 10 µg/mL de PsC 23F (50 µL/pocillo) y bloqueadas con 150 µL/pocillo de disolución de albúmina de suero bovino al 1 %, se les adicionaron los sueros extraídos luego de cada inmunización en diluciones dobles seriadas comenzando por 1/100 en disolución tamponada fosfato salina pH 7,2 más BSA 1 %, EDTA 0,01 M, Tween 20 0,3 %, incubándose durante 90 min a temperatura ambiente. Se adicionó el conjugado anti conejo-IgG peroxidasa (dilución 1/10000) y se incubó durante 90 min a temperatura ambiente. El revelado se realizó adicionando 100 µL/pocillo de orto-fenilendiamina 0,5 mg/mL en disolución citrato (Na₂HPO₄ 52 mM y ácido cítrico 25 mM, pH 5,6) y se mantuvo la placa en oscuridad durante 20 min. Se detuvo la reacción adicionando HCl 3M, se leyó la densidad óptica (DO) a una longitud de onda de 492 nm en un lector de ELISA. Al final de cada incubación se realizó el lavado de las placas con disolución de lavado (disolución tampón fosfato salina pH 7,2, Tween 20 0,05 %).

El cálculo del título de anticuerpos IgG se realizó mediante un análisis de regresión entre los valores de DO y el logaritmo en base 10 del recíproco de la dilución del suero. Para la selección de los animales respondedores, se consideró como valor de corte para la titulación, el doble del valor de absorbancia del suero preinmune (t=0) diluido 1/100, por tanto, el título de anticuerpos se expresó como el log10 de la dilución del suero que dio un valor de DO igual al doble del valor obtenido para el suero preinmune (t=0).

Evaluación de la conservación de la antigenicidad: Para la evaluación de la antigenicidad, se recubrieron las placas en las mismas condiciones que para el ELISA de titulación. Se adicionó el suero de referencia internacional contra el serogrupo 23 (1/6400), disuelto en solución tampón de dilución, previamente incubado durante toda la noche a 4 ºC, con diluciones seriadas 1/10 del PsC en un intervalo de concentraciones de 0,005 µg/mL hasta 500 µg/mL.

El resto del procedimiento se realizó de forma similar a lo descrito para la titulación contra el PsC. Los resultados se muestran como porcentaje de inhibición y se calculó según la siguiente fórmula: 1-[DO (sin inhibidor)-DO (con inhibidor) / DO (sin inhibidor)] X 100.

An�lisis Estad�stico

La influencia de la concentraci�n de PsFg-23F, los equivalentes de NaIO₄ y la temperatura en la reacci�n de oxidaci�n con NaIO₄ se realiz� a trav�s de un dise�o experimental factorial multinivel 3^3 (tabla 1). Se escogieron como variables respuestas; la cantidad de grupos carbonilos introducidos en la estructura del PsFg-23F, expresados como mol de grupo carbonilo por unidad repetitiva (UR), y el rendimiento de la reacci�n a trav�s del recobrado de PsFg-23F. El an�lisis estad�stico se realiz� a trav�s del programa estad�stico de computaci�n Statgraphics Centurion XV (StatPoint Inc. 1982-2007), se consider� significaci�n estad�stica para p = 0,05. Las diferencias en la respuesta de anticuerpos IgG anti-PsC 23F entre los distintos grupos experimentales se realiz� mediante la aplicaci�n de la prueba de Kruskal Wallis (no param�trico) y la prueba de Dunn a posteriori. Las diferencias se consideraron significativas para p = 0,05. El procesamiento estad�stico de los datos de todos los experimentos se realiz� con el programa GraphPad Prism, versi�n 4.00.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterizaci�n del PsC 23F mediante RMN ¹H

La identidad del PsC de Streptococcus pneumoniae serotipo 23F se realiz� mediante RMN ¹H. Se apreciaron las se�ales correspondientes a los grupos metilos de la a-L-ramnosa y �-L-ramnosa a 1,26 y 1,36 ppm respectivamente. Adem�s, se identificaron las se�ales correspondientes a los cuatro anom�ricos a 4,83; 4,85; 4,93 y 5,1 ppm lo cual coincide con lo reportado en la caracterizaci�n de la unidad repetitiva del serotipo 23F por RMN ¹H y con el espectro registrado para el PsC 23F ATCC de referencia. Adicionalmente se obtuvo un Ps de 23F sin sustituyente glicerol-fosfato seg�n lo descrito por James Richards en 1988 (17) para utilizarlo como referencia de afectaci�n del sustituyente glicerol-fosfato en los ensayos de identidad por RMN ¹H y de antigenicidad por ELISA.

Obtenci�n del PsFg-23F mediante hidr�lisis �cida

La fragmentaci�n de los PsC se implementa mediante m�todos f�sicos, mec�nicos y qu�micos. La disminuci�n de la talla del PsC 23F se estudi� mediante hidr�lisis �cida y se evaluaron dos tipos de �cidos en diferentes condiciones. Los resultados muestran que tanto con HAc como TFA se obtienen PsFg-23F con tallas entre 10-30 kDa, aunque los mejores rendimientos (84 %) se alcanzaron con TFA (tabla 2). Al ser el TFA un �cido m�s fuerte se requiere de un menor tiempo, as� como de una menor temperatura de reacci�n. Estos resultados son comparables con los reportados para la reducci�n de la talla molecular de polisac�ridos de neumococo por hidr�lisis �cida en cuanto a la eficiencia del TFA (19).

Un requisito muy importante al modificar los PsC para utilizarlos como antígenos de vacunas conjugadas es lograr conservar los epítopes B. La unidad repetitiva del PsC 23F presenta dos ramificaciones, un residuo de L-ramnosa que debe ser conservado ya que es un determinante antigénico, lo cual se demostró con sueros de conejos, de caballos y humanos (20). La otra ramificación es un sustituyente glicerol-fosfato de la cual no encontramos información sobre su importancia inmunológica. Ambas ramificaciones pueden sufrir hidrólisis con TFA (21) y de ser eliminadas pueden causar afectación de la antigenicidad del PsFg-23F.

Los espectros de RMN ¹H de los PsFg-23F obtenidos con ambos ácidos mostraron que todos conservaron la identidad de la unidad repetitiva al compararse con el espectro del PsC 23F, excepto cuando se utilizó TFA 0,25 M (figura 1A). En el espectro correspondiente se aprecia una señal en δ 5,12 ppm característica de la ausencia del sustituyente glicerol-fosfato (figura1B) y que se corresponde con la α-L-ramnosa según lo reportado por Richards en 1988 (17).

La antigenicidad se evaluó mediante un ELISA de inhibición, para lo cual se utilizó un suero de referencia específico contra el serogrupo 23. Las curvas de inhibición registradas con los diferentes fragmentos presentaron similitud a la obtenida para el PsC 23F, excepto para los fragmentos con afectaciones del sustituyente glicerol-fosfato (figura 2).

El PsC 23F sin sustituyente glicerol-fosfato obtenido como referencia del estudio no es capaz de inhibir al suero específico en un 100 %, y el PsFg-23F (0,25M de ácido trifluoroacético) con afectación parcial del sustituyente glicerol-fosfato necesitó más de 10 veces la concentración para alcanzar el 50% de inhibición en comparación con el resto de los derivados evaluados (figura 2). En nuestro caso, todos los fragmentos obtenidos se encuentran en el mismo intervalo de tallas moleculares (K_D), luego, la disminución de la antigenicidad está directamente relacionada con la afectación del sustituyente glicerol-fosfato. Este resultado indica que el glicerol-fosfato juega un rol fundamental en la antigenicidad del serotipo 23F, lo cual ha sido observado para el serotipo 18C de neumococo donde este sustituyente es un elemento importante en el reconocimiento por parte del sistema inmune (18).

Obtenci�n del PsOx-23F mediante la oxidaci�n con NaIO₄

La unidad repetitiva del PsC 23F presenta varios sitios posibles de ser oxidados, algunos de los cuales se localizan en el residuo de L-ramnosa de la cadena lateral, descrita como determinante antigénico (19). Con el objetivo de tener mayor conocimiento de la reacción de oxidación con NaIO₄ se realizó un diseño experimental multifactorial 3^3. El análisis estadístico arrojó que los parámetros equivalentes de NaIO₄ (p=0,000 para ambas variables) y la temperatura (p=0,0036 para nivel de oxidación y p=0,0001 para el rendimiento) influyen de manera significativa sobre el nivel de oxidación y los rendimientos obtenidos, aunque los equivalentes de NaIO₄ presentan mayor significación. De manera inesperada los resultados mostraron que la variación de la concentración de Ps en la reacción no influyó en ninguna de las variables evaluadas. Tanto los equivalentes de NaIO₄ como la temperatura tienen una relación directa con la generación de grupos aldehído (p= 0,0018).

Además, se realizó una evaluación de la conservación de la identidad y la antigenicidad sobre los PsOx-23F. Al comparar los espectros de RMN ¹H de PsOx-23F con diferentes contenidos de grupos carbonilos se observó afectación de la identidad de la UR del PsC 23F (figura 3). A medida que aumentó el número de grupos carbonilos generados, los espectros de RMN ¹H presentaron menor resolución. El análisis espectroscópico muestra una disminución de la intensidad relativa de la señal correspondiente al grupo metilo de la α-L-ramnosa (δ 1,26 ppm) y un aumento de las señales a δ 1,20; 2,04; 2,14 y 5,20 ppm, respectivamente. Se puede relacionar la señal de 1,20 ppm con el grupo metilo de la ramnosa lateral oxidada y la señal de δ 5,20 ppm con el carbono anomérico de este sustituyente. El conjunto de modificaciones apreciadas evidencian que desde la generación de un carbonilo cada 2,5 UR existe afectación de la identidad de la UR en el PsOx-23F. Por otro lado, a medida que se aumenta la oxidación sobre el Ps 23F ocurre afectación de la antigenicidad, la cual es marcada en el máximo nivel de activación evaluado (C = O:1 UR) (figura 4), por lo que se aprecia una correspondencia con los resultados obtenidos en el análisis espectroscópico. Lo anterior indica que la disminución de la antigenicidad se debe a la oxidación excesiva del residuo de α-L-ramnosa, donde se encuentran los sitios más susceptibles a la oxidación (20) y al mismo tiempo es un determinante antigénico (21).

Se realizaron 5 réplicas de las condiciones de oxidación para obtener un grupo carbonilo entre 5-7 UR. Se obtuvo un rendimiento promedio de 76,4 %; un nivel de oxidación de un grupo carbonilo cada 6,2 y una K_D promedio de 0,55. El espectro del PsOx-23F mostró todas las señales características del PsC 23F natural. Además, se observan los cuatros protones anoméricos, con intensidades relativas similares a las del PsFg-23F, que indica que se conservó la cadena lateral.

Por otro lado no se observaron señales relacionadas con la afectación del sustituyente glicerol-fosfato, el cual es imprescindible para mantener la antigenicidad del PsC 23F. No obstante, se apreciaron nuevas señales a δ 1,20; 2,04; 5,20; 6,59 y 9,22 ppm, aunque todas con baja intensidad relativa. Estos corrimientos químicos están relacionados con los cambios estructurales que provocaron la generación de los grupos carbonilos en la estructura del PsOx-23F como se describió anteriormente.

Conjugaci�n del PsOx-23F a la prote�na portadora toxoide tet�nico

Se seleccionó un PsOx-23F con un carbonilo cada 6 UR y se conjugó a la proteína portadora TT mediante la reacción de aminación reductiva para conocer si estos podían inducir una respuesta inmune específica contra el PsC 23F. Las caracter�sticas de los conjugados obtenidos fueron: un recobrado superior al 48 %, una relaci�n carbohidrato: prote�na en el intervalo de 1,1:1 hasta 1:1,2 y un porcentaje de prote�na no conjugada promedio de 12,5 %, determinada en columna SUPEROSA 12.

Todos los valores obtenidos de la relaci�n carbohidrato: prote�na se encuentran incluidos en el intervalo recomendado por la OMS para la obtenci�n de vacunas conjugadas de neumococo (11). Adem�s, el an�lisis en cromatograf�a l�quida de alta resoluci�n en columna de exclusi�n molecular arroj� una KD de 0,33 en columna TSK 5000. Los t�tulos de IgG contra el PsC 23F inducido por el conjugado fueron superiores con significaci�n estad�stica a los inducidos por el grupo inmunizado con PsC 23F luego de la segunda y tercera dosis (figura 5). Por otro lado, el conjugado increment� la generaci�n de IgG despu�s de cada inmunizaci�n, aunque solo fue estad�sticamente significativa luego de la segunda dosis.

Siete d�as posteriores a la inmunizaci�n con polisac�rido capsular, se observ� un incremento significativo de los t�tulos de IgG, solo en el grupo previamente inmunizado con conjugado. Esto indica que la respuesta inmune generada por los conjugados fue capaz de inducir memoria inmunol�gica, que supone la presencia de poblaciones espec�ficas al PsC de c�lulas B de memoria, lo cual es caracter�stico de ant�genos de tipo T dependientes.

Los resultados experimentales permiten concluir que se puede utilizar la hidr�lisis �cida para la fragmentaci�n del PsC 23F de manera que se conserve la identidad de la UR y la antigenicidad del Ps. El sustituyente glicerol-fosfato presente en el PsC 23F es importante para el reconocimiento por los anticuerpos, por lo cual debe ser conservado. La oxidaci�n pery�dica sobre el polisac�rido 23F debe ser controlada para evitar la disminuci�n de la antigenicidad por la afectaci�n del residuo de L-ramnosa. Los conjugados obtenidos por esta v�a generan una respuesta T-dependiente espec�fica contra el polisac�rido capsular serotipo 23F.

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Recibido: Noviembre de 2016              Aceptado: Enero de 2017