ARTÍCULO ORIGINAL
Incremento en la capacidad de procesamiento para la producci�n de N-Glicolil GM3
Increase in processing capacity for N-Glicolil GM3 production
Julia M. Guti�rrez-Anillo1,2*, Jos� A. Gonz�lez-Lavaut,1 Layda Gonz�lez-Villanueva,1 Yanelis Navarrete-Pita,1 Jes�s Cancio-M�ndez,1 Nelson Garc�a-Gonz�lez1
1 Instituto Finlay de Vacunas. Ave. 27 No. 19805, La Lisa, La Habana, Cuba.
2 Facultad de Ingenier�a Qu�mica, Instituto Superior Polit�cnico Jos� Antonio Echevarr�a. Boyeros, La Habana, Cuba.
email: jgutierrez@finlay.edu.cu
* Ingeniera Qu�mica, Especialista en Investigaci�n, Innovaci�n y Desarrollo.
RESUMEN
El N-Glicolil GM3 es un monosialilgangliósido utilizado como antígeno y adyuvante en preparaciones vacunales para uso terapéutico contra cáncer de mama, pulmón y melanoma. La obtención de este gangliósido a partir de eritrocitos equinos consta de dos etapas: extracción y purificación, en las que se trabaja para incrementar los volúmenes de procesamiento. La evaluación del incremento en la capacidad de procesamiento, su influencia en el rendimiento y la evaluación del comportamiento del proceso de purificación utilizando Cromatografía Líquida de Alta Resolución Preparativa constituyeron objetivos del presente trabajo. Se compararon los resultados obtenidos entre el procedimiento aprobado y la propuesta de cambio. Se controló el proceso evaluando las características organolépticas y el peso del extracto liofilizado, así como la detección y contenido de N-Glicolil GM3 por Cromatografía de Placa Delgada cualitativa y análisis colorimétrico de ácido siálico; se utilizó el Software STATGRAPHICS para evaluar la variabilidad del proceso. El incremento del volumen de procesamiento respecto al procedimiento establecido mantuvo el rendimiento en la etapa de extracción y aumentó ligeramente el de la purificación, reduciéndose el tiempo de procesamiento con la utilización de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución Preparativa. El aumento de la capacidad de procesamiento mantuvo el rendimiento global del proceso en 0,006 g de N-Glicolil GM3/g de Eritrocitos y el producto obtenido mediante el procedimiento propuesto cumplió las especificaciones de calidad establecidas para el mismo; permitiendo un aumento en la productividad de 30%, menor consumo de energía y desgaste de los recursos humanos, siendo factible implementar el cambio.
Palabras clave: gangli�sidos, vacunas, c�ncer.
ABSTRACT
The N-Glicolil GM3 is a monosialilganglioside used as antigen and adjuvant in vaccines preparations for therapeutic use against breast, lung and melanoma cancer. The obtaining process of this ganglioside from equine erythrocytes comprises two stages: extraction and purification, in which we work to increment processing volumes. The assessment of increment in the processing capacity, its influence on the performance and the evaluation of purification process behavior by Preparative High-Performance Liquid Chromatography (Prep HPLC) constituted the objectives of this paper. The results obtained from the approved procedure and the proposal of change were compared. The process was controlled by evaluating the organoleptic characteristics and weight of lyophilized extract, as well as the detection and content of N-Glicolyl GM3 by Qualitative Thin Layer Chromatography and colorimetric analysis of sialic acid; STATGRAPHICS software was used to assess the process variability. The increment in processing volume regarding the established procedure remained the extraction stage performance and incremented slightly the purification performance, by reducing the processing time with the use of Prep HPLC. The increment of processing capacity maintained the overall performance of the process in 0,006 g of N-Glicolyl GM3/g of erythrocytes and the product obtained by means of the proposed method fulfilled the quality specifications established for the same; allowing an increment in productivity by 30%, less energy consumption and less exhaustion of human resources, being feasible to implement the change.
Keywords: gangliosides, vaccines, cancer.
INTRODUCCIÓN
Los gangli�sidos son constituyentes normales de la membrana plasm�tica de las c�lulas de vertebrados, involucrados en la regulaci�n de importantes funciones celulares como el crecimiento y desarrollo embrionario, transducci�n de se�ales, receptores para virus y toxinas bacteriales, tumorog�nesis y met�stasis siendo uno de los sistemas antig�nicos m�s estudiados y candidatos atractivos para la inmunoterapia del c�ncer (1-7).
N-Glicolil GM3 (NGcGM3) es un monosialilgangli�sido utilizado como ant�geno y adyuvante en diversas preparaciones vacunales para uso terap�utico contra el c�ncer de mama, pulm�n y melanoma, las cuales producen un incremento significativo en la supervivencia y una reducci�n en el crecimiento tumoral, sin generar toxicidad aparente o mortalidad (2, 8-13). La importancia socioecon�mica que reviste la vacuna terap�utica NGcGM3/VSSP para el pa�s, demanda una capacidad de producci�n superior de este gangli�sido. La obtenci�n de NGcGM3 a partir de eritrocitos equinos se realiza mediante dos etapas fundamentales: extracci�n (s�lido-l�quido y l�quido-l�quido) y varios procesos de purificaci�n (di�lisis, liofilizaci�n, cromatograf�a de adsorci�n e intercambio i�nico). Los m�todos descritos por diferentes autores para la extracci�n y purificaci�n de gangli�sidos a partir de fuentes naturales coinciden, generalmente en cuanto a las operaciones empleadas y difieren en los disolventes, su polaridad y la proporci�n en que son utilizados, as� como las relaciones entre la masa de material a extraer y el volumen de disolvente, la forma de adici�n de los mismos y el n�mero de etapas de extracci�n (14-16).
La evaluaci�n del incremento en la capacidad de procesamiento en las etapas de extracci�n y purificaci�n, su influencia en el rendimiento y la evaluaci�n del comportamiento del proceso de purificaci�n utilizando Cromatograf�a L�quida de Alta Resoluci�n (HPLC) Preparativa KNAUER constituyen objetivos del presente trabajo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se evaluaron 25 lotes de producci�n de NGcGM3 en los cuales se utilizaron como materia prima eritrocitos equinos suministrados por Internegocios S.A., Argentina. Se realizaron 17 lotes mediante el procedimiento que permite procesar 1,5 kg de eritrocitos y ocho lotes se desarrollaron procesando 3 kg de eritrocitos que constituye el cambio propuesto. La etapa extractiva se realiz� mediante una extracci�n s�lido-l�quido de eritrocitos equinos en dos etapas, utilizando una mezcla cloroformo: metanol 1:1 (v/v) en la primera extracci�n y 2:1 (v/v) en la segunda extracci�n, durante 24 a 36 h a temperatura ambiente controlada y agitaci�n de 300 a 500 rpm. La suspensi�n resultante fue filtrada al vac�o y concentrada por rotoevaporaci�n hasta sequedad. Posteriormente se realiz� un proceso de eliminaci�n de impurezas por hidr�lisis b�sica con disoluci�n de hidr�xido de sodio/metanol 0,2 mol/L y extracci�n l�quido-l�quido con n-hexano; la fase metan�lica se concentr� hasta sequedad, se someti� a un proceso de di�lisis durante 72 horas a 4�C. El producto se distribuy� en matraces de fondo redondo a raz�n de 100 mL, se congel� en nitr�geno l�quido y se liofiliz� en un liofilizador de mesa CHRIST ALPHA 1-4 durante 24 a 48 h, con un vac�o de 0,1 a 0,2 mbar, obteniendo un polvo seco de color pardo o carmelita.
En la etapa de purificaci�n el extracto liofilizado se purific� por cromatograf�a de adsorci�n con un equipo de Cromatograf�a L�quida de Presi�n Media (MPLC), empleando cloroformo: metanol: amoniaco/agua (65:25:4; v/v) como fase m�vil y s�lica gel 60 como fase estacionaria. Se colectaron las fracciones en que se detect� presencia de NGcGM3 por Cromatograf�a de Placa Delgada (CCD) cualitativa y se concentraron por rotoevaporaci�n hasta sequedad. Se realiz� la purificaci�n por intercambio i�nico en DEAE Sephadex A-25 utilizando como fase m�vil cloroformo: metanol: agua (30:60:8; v/v) y acetato de sodio/metanol 0,2 mol/L, evaluando el proceso por CCD.
Las fracciones que contienen el gangli�sido se concentraron por rotoevaporaci�n hasta sequedad y se dializaron por 72 h a 4 �C. Se estableci� el contenido de NGcGM3 en el producto final dializado de acuerdo a la determinaci�n de �cido si�lico por colorimetr�a, se dosific� en matraces la cantidad requerida para garantizar 500 mg de NGcGM3 por envase y se liofiliz� durante 24 a 36 h en iguales condiciones de operaci�n quedando el producto como un polvo de apariencia esponjosa o granulada de color blanco a crema.
Paralelamente se evalu� la introducci�n de un HPLC Preparativo KNAUER en el proceso de purificaci�n por adsorci�n. Se realiz� un proceso isocr�tico con un flujo de 30 mL/min, utilizando un detector UV a una longitud de onda de 242 nm y el programa ChromGate para la adquisici�n de datos. Se compararon los resultados para la propuesta de cambio evaluada entre los dos procesos cromatogr�ficos (MPLC y HPLC). Se control� cualitativamente el comportamiento del proceso en la etapa extractiva, evaluando las caracter�sticas organol�pticas y el peso del extracto liofilizado, estableci�ndose el rendimiento de la etapa expresado como Masa de Extracto Liofilizado obtenido/ Masa de Eritrocitos consumidos. El desempe�o del proceso durante la etapa de purificaci�n se evalu� mediante CCD cualitativo y determinaci�n del contenido de NGcGM3 por el m�todo Svennerholm (17), al concluir la purificaci�n por adsorci�n y antes de liofilizar el producto final dializado para determinar los rendimientos de la etapa de purificaci�n y el global del proceso expresados como Masa de NGcGM3 obtenido/ Masa de Extracto Liofilizado purificado y Masa de NGcGM3 obtenido/ Masa de Eritrocitos consumidos, respectivamente. De manera gr�fica se muestra el comportamiento del proceso mediante gr�ficos de control para los datos obtenidos de rendimiento de la etapa de extracci�n, rendimiento de la etapa de purificaci�n y rendimiento global del proceso para ambos procedimientos; utilizando el Software STATGRAPHICS Plus Versi�n 5.1 para la evaluaci�n de la variabilidad del proceso. Los ensayos de identidad mediante la t�cnica espectrosc�pica de Resonancia Magn�tica Nuclear (RMN) constituyen par�metros de calidad establecidos para este producto. El RMN se registr� en un espectr�metro Bruker/Avance DPX-250. El FID (Free Induction Decay o Ca�da Libre de Inducci�n) de RMN 1H se obtuvo a una frecuencia de 250,13 MHz con 16 barridos, 32 k de adquisici�n de datos y un ancho espectral de 2000 Hz.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La evaluaci�n del incremento en los vol�menes de procesamiento para satisfacer la demanda de producto requerida, parti� del an�lisis de la posibilidad de duplicar la cantidad de eritrocitos procesada mediante el procedimiento establecido, tomando como base el equipamiento disponible. La informaci�n referente a cada uno de los lotes procesados con ambos procedimientos y los resultados de los principales par�metros del proceso se refleja en las Tablas 1 y 2.
Se considera oportuno se�alar que las variaciones observadas en los resultados para lotes procesados con igual procedimiento se deben en gran medida al hecho de que el tipo y la concentraci�n de gangli�sidos presentes en la membrana plasm�tica dependen de variados factores tales como la especie, edad, grado de desarrollo, el tejido considerado, estados fisiol�gicos, alimentaci�n, temperatura ambiente y el efecto de compuestos qu�micos, entre otros; tributando de esta forma a la variabilidad propia de un proceso productivo desarrollado a partir de fuentes naturales (6, 16). El peso promedio del extracto liofilizado para los lotes procesados seg�n el procedimiento establecido fue de 11,393 g mientras para la propuesta de cambio analizada fue 23,094 g. Puede notarse que el peso del extracto liofilizado en esta �ltima es el doble del obtenido para el procedimiento aprobado; sin embargo, se mantiene el rendimiento promedio de la etapa de extracci�n en 0,008 g de extracto liofilizado/ g de eritrocitos utilizados, para ambos.
Analizando el comportamiento del proceso en la etapa de purificaci�n se observa que el contenido de NGcGM3 en el volumen total de fracciones colectadas en la adsorci�n para la propuesta de cambio es 2,4 veces superior al obtenido con el procedimiento establecido, increment�ndose el rendimiento de este proceso en un 15%. Al realizar igual an�lisis para la etapa de purificaci�n incluyendo la adsorci�n, intercambio i�nico y la di�lisis se detecta que el peso de NGcGM3 obtenido para la propuesta de cambio es 2,2 veces el alcanzado con el procedimiento establecido mientras el rendimiento de la etapa es ligeramente superior para el cambio evaluado (incremento aproximado de 5%).
Comparando el rendimiento global del proceso para la propuesta de cambio con el del procedimiento aprobado, puede notarse que este par�metro se mantiene para ambos procedimientos en 0,006 g de NGcGM3/g de eritrocitos, obteni�ndose con el cambio evaluado 2,2 veces la cantidad de NGcGM3 alcanzada con el proceso aceptado. Estos resultados indican que el incremento en los vol�menes de procesamiento permite aumentar la cantidad de producto obtenido sin afectar los rendimientos del proceso.
La utilizaci�n del HPLC Preparativo en la purificaci�n por adsorci�n en las condiciones establecidas, reduce el tiempo de procesamiento de 12 a 8 h, considerando que se procesara la cantidad de extracto liofilizado obtenida con el incremento del volumen de producci�n en el sistema establecido (columna de vidrio borosilicato, de longitud 460 mm y di�metro interno 26 mm, flujo de 10 - 15 mL/min. utilizando bomba de MPLC) para el procedimiento instituido. El nuevo sistema permite la adquisici�n de los datos en tiempo real, brindando evidencia confiable del comportamiento del proceso; contribuye adem�s al ahorro de disolventes y energ�a, as� como la disminuci�n del tiempo de operaci�n y manipulaci�n logrando un proceso m�s eficaz, con un aumento del 30% en la productividad. Se realizaron de forma preliminar gr�ficos de control para los datos obtenidos de rendimiento de la etapa de extracci�n, rendimiento de la etapa de purificaci�n y rendimiento global del proceso para ambos procedimientos.
El gr�fico de control permite analizar el comportamiento de un proceso, determinando si los datos de los par�metros del mismo est�n en un estado de control estad�stico; para ello es preciso que los datos analizados procedan de una distribuci�n normal y por tanto previo a la confecci�n de un gr�fico se requiere realizar pruebas de normalidad. Con el objetivo de facilitar la interpretaci�n de los par�metros evaluados, los valores de rendimiento global del proceso fueron afectados por m�ltiplos de 10. El procesamiento de los datos para este prop�sito se efectu� mediante el Software STATGRAPHICS Plus Versi�n 5.1 y los resultados se muestran en las Figuras 1, 2 y 3. Se observa en los gr�ficos (Figura 1) que de los 17 y 8 puntos incluidos para el procedimiento establecido y la propuesta de cambio, respectivamente, ning�n valor se encuentra fuera de los l�mites de control. Puesto que la probabilidad de que aparezcan 0 o m�s puntos fuera de l�mites s�lo por azar es 1,0, si los datos proceden de una distribuci�n normal, no puede rechazarse la hip�tesis de que ambos procesos se encuentran en estado de control estad�stico para un nivel de confianza del 95%.
Los gr�ficos de control para el par�metro de rendimiento de la purificaci�n (Figura 2) muestran de igual forma que de los 17 y 8 puntos no excluidos mostrados para cada procedimiento, ninguno est� fuera de los l�mites de control. Realizando el mismo an�lisis, no puede rechazarse la hip�tesis de que los procesos evaluados est�n en estado de control estad�stico para un nivel de confianza del 95%. Referente al rendimiento global del proceso los gr�ficos de control, tanto para el procedimiento establecido como para la propuesta de cambio evaluada (Figura 3), muestran igualmente que de los 17 y 8 puntos no excluidos respectivamente, no existe ninguno fuera de los l�mites de control. Considerando iguales observaciones en cuanto a la probabilidad que en los gr�ficos anteriores, puede considerarse que ambos procesos est�n en estado de control estad�stico con un nivel de confianza del 95%. La data del proceso utilizada para realizar los gr�ficos de control no es suficiente para efectuar un an�lisis estad�stico completo, pero permite tener una idea del comportamiento del proceso productivo establecido y de la propuesta de cambio evaluada. El an�lisis de los gr�ficos y par�metros estad�sticos permite adem�s establecer que para ambos procedimientos el proceso est� en estado de control para un nivel de confianza del 95 %.
Es necesario se�alar que estos resultados, a pesar de brindar una noci�n preliminar, no son conclusivos; es imprescindible analizar la informaci�n recopilada de mayor n�mero de lotes. El NGcGM3 obtenido con el incremento en la capacidad de procesamiento evaluado, muestra un espectro de RMN 1H correspondiente con el espectro de referencia. Aparecen dos multipletos en δ = 5,5 y 5,38 ppm correspondientes a los protones olefínicos de la ceramida, dos dobletos en δ = 4,23 y 4,17 ppm de los protones anoméricos de la β-D-galactosa y la β-D-glucosa, un singuleto en δ = 3,87 ppm propio de los protones metilénicos del grupo N-glicolil del ácido siálico, señales múltiples de δ = 1,6 a 1,1 ppm de los protones metilénicos de la ceramida, un tripleto en δ = 0,86 ppm de los protones metílicos de la ceramida, además de las señales correspondientes a la dimetilformamida y el dimetilsulfóxido empleados en la preparación analítica Estos resultados permiten corroborar que el NGcGM3 obtenido mediante la propuesta evaluada cumpli� los requerimientos de calidad establecidos para este producto. En la figura 4 se muestra el espectro de RMN 1H, donde se identifican las se�ales antes descritas. Los resultados expuestos indican que el incremento del volumen de procesamiento respecto al procedimiento establecido mantuvo el rendimiento en la etapa de extracci�n y en el proceso de forma global y alcanz� rendimientos ligeramente superiores en la purificaci�n. El producto obtenido a partir de la propuesta de cambio evaluada cumpli� con las especificaciones de calidad establecidas para NGcGM3 por lo que es factible implementar el cambio.
CONCLUSIONES
El incremento de la capacidad de extracción mantuvo el índice de rendimiento de la etapa extractiva del procedimiento establecido. Mientras, el incremento de la capacidad de procesamiento en la purificación aumentó ligeramente el rendimiento en esta etapa y se mantuvo el rendimiento global del proceso en 0,006 g de N-Glicolil GM3 /g de Eritrocitos. Paralelamente la utilización del nuevo sistema HPLC Preparativo KNAUER permite reducir el tiempo de procesamiento, brindando evidencia confiable del comportamiento del mismo; lográndose un proceso más eficaz con menor consumo de disolventes, energía y tiempo de operación y manipulación del personal.
De igual forma el análisis del comportamiento de la producción durante las etapas de extracción y purificación, así como del proceso en su conjunto permitió establecer que tanto para el procedimiento aprobado como para la propuesta de cambio evaluada el proceso está en estado de control estadístico para un nivel de confianza del 95%. El producto obtenido mediante el procedimiento a escala superior cumplió con las especificaciones de calidad establecidas para el mismo; permitiendo un aumento en la productividad de un 30%, menor consumo de energía y menor desgaste de los recursos humanos, por lo que se propone implementar el cambio de escala productiva.
REFERENCIAS
1. Mulens V, Marinello P, Carr A, Mazorra Z, Fernández LE. Gangliósidos en la Biología e Inmunoterapia del Cáncer: la Experiencia Cubana. Cancerología 2009;4:155-67.
2. Zancada L. Estudio del contenido de oligosacáridos, glicolípidos y fosfolípidos de la leche de oveja. Participación en la defensa del recién nacido frente a infecciones [Tesis Doctoral]. Salamanca: Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca; 2008.
3. Bada A, Casacó A, Arteaga M, Martínez J, León A, Santana E, et al. Toxicity of a GM3 cancer vaccine in Macaca fascicularis monkey: a 12-month study. Human & Experimental Toxicology 2002;21(5):263-7.
4. Hanais N, Dohi T, Norese G, Hakomori S. A Novel Ganglioside, De-N-acetyl-GM3 (II3NeuNH2LacCer), acting as a Strong Promoter for Epidermal Growth Factor Receptor Kinase and as a Stimulator for Cell Growth. The Journal of Biological Chemistry 1988;263(13):6296-301.
5. Izquierdo N, Lorizate M, Contreras FX, Rodríguez MT, Glass B, Erkizia I, et al. Sialyllactose in Viral Membrane Gangliosides Is a Novel Molecular Recognition Pattern for Mature Dendritic Cell Capture of HIV-1. PLoS Biol 2012;10(4):e1001315. doi:10.1371/journal.pbio.1001315.
6. Puente R. Gangliósidos de la leche: variaciones de su contenido en diferentes etapas de la lactación. Estudio de su posible función. [Tesis Doctoral]. León: Facultad de Biología, Universidad de León; 1992.
7. Regalado A, Mesa M, Chávez D, González R, Monteserín LA, Rodríguez MC, et al. A New and Efficient Approach to Prepare N-acetyl GM Ganglioside Via Trisaccharide [1→4] Lactone. Organic Process Research & Development 2013;17(1):53–60.
8. Mazorra Z. El gangliósido GM3 como blanco en la inmunoterapia del melanoma. [Tesis Doctoral]. La Habana: Centro de Inmunología Molecular; 2007.
9. Garrido R, Veloso RC, López M, González JA, Rodríguez MC, Vélez H, et al. Evaluation and evidences of natural gangliosides with two unsaturated bonds in the ceramide structure by combination of MALDI-MS and NMR. Anal Bioanal. Chem. 2011;400(10):3675-80.
10. Carr A, Mazorra Z, Alonso DF, Mesa C, Valiente O, Gómez DE, et al. A purified GM3 ganglioside conjugated vaccine induces specific, adjuvant-dependent and non-transient antitumour activity against B16 mouse melanoma in vitro and in vivo. Melanoma Research 2001;11:219-27.
11. Arango MC, González A. Vacunas terapéuticas en cáncer: Ensayos clínicos actuales. Revista Cubana de Medicina 2002;41(6). Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-75232002000600009&lng=es.
12. Portoukalian J, Carrel S, Doré JF, Rümke P. Humoral Immune Response in Disease-free Advanced Melanoma Patients after Vaccination with Melanoma- associated Gangliosides. Int. J. Cancer 1991;49(6):893-9.
13. Alvarez N, Desselle A, Cochonneau D, Chaumette T, Clemenceau B, et al. A Monoclonal Antibody to O-Acetyl-GD2 Ganglioside and Not to GD2 Shows Potent Anti-Tumor Activity without Peripheral Nervous System Cross-Reactivity. PLoS ONE 2011;6(9):e25220. doi: 10.1371/journal.pone.0025220
14. Folch-Pi J, Arsove S, Meath JA. Isolation of Brain Strandin, a New Type of Large Molecular Tissue Component. The Journal of Biological Chemistry 1951;191:819-31.
15. Wang WQ, Gustafson A. Erythrocyte Lipid Extraction in Alcohol-Chloroform Ganglioside Systems: A Comparative Study. Acta Chemica Scandinavica 1994;48:753-8.
16. Wang WQ, Gustafson A. Ganglioside Extraction from Erythrocytes: a Comparison Study. Acta Chemica Scandinavica 1995;49:929-36.
17. Svennerholm L. Quantitative estimation of sialic acids. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochimica et Biophysica Acta 1957;24:604-11.
Recibido: Mayo de 2016 Aceptado: Julio de 2016