Art�culo Original

Estandarizaci�n de un ELISA para la cuantificaci�n de anticuerpos IgG humanos contra c�lulas enteras de Bordetella pertussis

Standardization of an ELISA for the quantification of human IgG antibodies against whole cells of Bordetella pertussis

Dayle Mart�nez-Bedoya^* ����ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8740-4937

Rocmira P�rez-Nicado^** �����ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1657-6130

Samantha Fern�ndez-Gonz�lez����� ORCID: https://orcid.org/0009-0000-7080-9794

Yamilka Soroa-Mill�n����� ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5218-4169

Yisabel Aranguren-Mazorra����� ORCID: https://orcid.org/0009-0001-1758-938X

Ayl�n Amador-G�mez ^����ORCID: https://orcid.org/0009-0007-7265-2103

Laura M. Rodr�guez-Noda���� ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0171-4681

Dagmar Garc�a-Rivera����� ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2099-1791

Instituto Finlay de Vacunas. La Habana, Cuba.

Autor para correspondencia: dmartinez@finlay.edu.cu; rpnicado@finlay.edu.cu.

RESUMEN

Bordetella pertussis es un pat�geno exclusivo de humanos que causa la tos ferina, enfermedad respiratoria aguda que afecta principalmente a la poblaci�n pedi�trica. Existen dos tipos de vacunas comercializadas contra este pat�geno: celulares y acelulares. Las vacunas celulares han sido extensamente utilizadas y siguen teniendo gran relevancia. El presente trabajo tuvo como objetivo la estandarizaci�n de un ELISA para la cuantificaci�n de anticuerpos IgG contra c�lulas enteras de Bordetella pertussis. Para ello se determin� la concentraci�n de recubrimiento, el rango lineal de la curva, los par�metros de precisi�n intra e interensayo, la especificidad, el valor de corte y el l�mite de detecci�n. Se determin� como concentraci�n de recubrimiento 0,5 UO/mL de c�lulas enteras. La curva est�ndar utilizando un suero de referencia internacional present� un buen ajuste a una funci�n polin�mica en un intervalo entre las diluciones 1/100 y 1/24.300 con un coeficiente de correlaci�n R²≥0,98. Los coeficientes de variaci�n en los ensayos de precisi�n intra e interensayo estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (≤10%, ≤20% respectivamente). Los resultados obtenidos avalan el empleo de este ELISA cuantitativo para la evaluaci�n de la respuesta a c�lulas enteras de Bordetella pertussis en ensayos cl�nicos.

Palabras clave: Bordetella pertussis; tos ferina; vacunas; ELISA; anticuerpos; IgG.

ABSTRACT

Bordetella pertussis is a pathogen exclusive to humans that causes pertussis, an acute respiratory disease that mainly affects the pediatric population. There are two types of vaccines commercially available against this pathogen: cellular and acellular. Cellular vaccines have been widely used and continue to be of great relevance. The aim of the present work was to standardize an ELISA for the quantification of IgG antibodies against whole cells of Bordetella pertussis. For this purpose, the coating concentration, the linear range of the curve, the intra- and inter-assay precision parameters, the specificity, the cut-off value and the detection limit were determined. The coating concentration was determined as 0.5 UO/mL of whole cells. The standard curve using an international reference serum presented a good fit to a polynomial function in a range between dilutions 1/100 and 1/24,300 with a correlation coefficient R2≥0.98. The coefficients of variation in the intra- and inter-assay precision tests were in the intervals established for each (≤10%, ≤20% respectively). The results obtained support the use of this quantitative ELISA for the evaluation of whole-cell response to Bordetella pertussis in clinical trials.

Keywords: Bordetella pertussis; whooping cough; vaccines; ELISA; antibodies; IgG.

Recibido: 9 de junio de 2023

Aceptado: 1 de noviembre de 2023

Introducci�n

Bordetella pertussis es un pat�geno exclusivo de humanos, en los que produce una enfermedad respiratoria aguda altamente contagiosa llamada tos ferina, tos convulsa o coqueluche.⁽¹⁾ Esta bacteria produce la exotoxina pertussis, que impide la s�ntesis de prote�nas en las c�lulas ciliadas del tracto respiratorio y produce necrosis por la acumulaci�n de monofosfato de adenosina c�clico, lo que inmoviliza los cilios incrementando la producci�n y secreci�n de mucus en las v�as respiratorias.⁽²⁾

La B. pertussis se transmite de persona a persona a trav�s de la inhalaci�n o el contacto de las mucosas con gotitas de aerosol generadas al hablar, toser o estornudar, o procedentes de secreciones respiratorias de personas infectadas. El per�odo de incubaci�n oscila entre 1 y 2 semanas hasta causar tos ferina. A pesar de ser considerada una enfermedad de la infancia, eventualmente podr�a afectar a cualquier grupo de edad, como adolescentes y adultos j�venes en los que muchas veces no se identifica la enfermedad como tal, pero act�an como fuente de contagio para neonatos y lactantes. La edad en que ocurre la mayor incidencia es en lactantes menores de 4 meses, que no han completado el esquema de tres dosis de vacunaci�n, raz�n por la cual este grupo es m�s vulnerable a complicaciones como neumon�a e infecciones graves asociadas a altas tasas de mortalidad. Globalmente se estima que cada a�o se reportan m�s de 16 millones de casos de tos ferina y aproximadamente 195.000 muertes.⁽³⁾

La vacunaci�n es la principal medida preventiva frente a la tos ferina, ya que posee una eficacia demostrada del 80-85%, lo que ha permitido reducir la incidencia de la enfermedad y su mortalidad. Actualmente, existen dos tipos de vacunas comercializadas contra B. pertussis, una compuesta por c�lulas enteras inactivadas y la otra constituida por ant�genos altamente purificados o vacuna acelular. Estas vacunas son usualmente combinadas con otros ant�genos (difteria, t�tanos, hepatitis B, Haemophilus influenzae tipo b, poliovirus inactivados). Seg�n los esquemas de vacunaci�n, se deben administrar tres dosis durante el primer a�o de vida y, al menos, una dosis de refuerzo antes de los 2 a�os de edad.⁽³⁾

Varios estudios han demostrado que la protecci�n que brinda la vacunaci�n disminuye con el tiempo, esto explica por qu� se afectan m�s los adolescentes y adultos j�venes que recibieron la vacuna hace varios a�os, as� como los lactantes que no est�n protegidos por los anticuerpos de su madre a trav�s de la lactancia.⁽⁴⁾ Existe poca informaci�n de la duraci�n exacta de la respuesta inmune inducida por ambos tipos de vacunas y esto se debe a no contar con un correlato de protecci�n fiable. Investigaciones recientes han sugerido que las vacunas compuestas por c�lulas enteras inactivadas protegen durante per�odos m�s largos de tiempo que las acelulares.⁽⁵⁾ Cuba produce y utiliza vacunas combinadas que incluyen c�lulas enteras inactivadas de B. pertussis.⁽⁶⁾

La cuantificaci�n de anticuerpos IgG contra c�lulas enteras de B. pertussis por la t�cnica de ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay, por sus siglas en ingl�s) se utiliza para estudiar la respuesta inmune inducida por estas vacunas.⁽⁷⁾ Debido a inconvenientes en la adquisici�n de estuches comerciales, nos hemos propuesto como objetivo estandarizar un ensayo inmunoenzim�tico tipo ELISA para la cuantificaci�n de IgG contra c�lulas enteras de B. pertussis en muestras de sueros de ni�os entre 1 y 5 a�os de edad.

Materiales y M�todos

Determinaci�n de la concentraci�n de recubrimiento

Para determinar la concentraci�n de recubrimiento, placas de 96 pocillos MaxiSorp (Nunc, Dinamarca) se recubrieron con diluciones seriadas dobles de c�lulas enteras inactivadas de B. pertussis (100 μL/pocillo), en el rango de 8 - 0,04 Unidades de opacidad (UO)/mL, disueltas en soluci�n salina tamponada con fosfatos (SSTF) 1X (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 4,3 mM Na₂HPO₄*7H₂O; 1,4 mM KH₂PO₄), pH 7,2 � 0,2. Despu�s de incubadas las placas durante 12-18 h a 4�C, fueron lavadas tres veces con soluci�n de lavado (SSTF 1X y 0,05% de Tween 20). Se emple� como control positivo el suero de referencia internacional (SRI) 06/142 del NIBSC; como control negativo, sueros de humanos no reactivos a la bacteria y el blanco reactivo fue la soluci�n de anticuerpos (SSTF 1X; 0,05% Tween 20 y NaN_3; pH 7,2 � 0,2).

Se escogi� como concentraci�n de recubrimiento, la menor concentraci�n donde se alcanzaron las densidades �pticas (D.O) deseadas para el suero control positivo sin la ocurrencia de valores de fondos, es decir, donde se observ� la mayor diferencia entre las D.O del suero control positivo y el blanco span class=GramE>reactivo.⁽⁸⁾

ELISA

Para las diferentes evaluaciones se utiliz� un ensayo inmunoenzim�tico en fase s�lida, cuantitativo, de tipo indirecto. Se realiz� el recubrimiento con la concentraci�n seleccionada, tal como se describi� en el ac�pite anterior. Luego de lavadas las placas, se procedi� a adicionar 100 μL/pocillo (por duplicado) de las muestras de los sueros problema, los controles y la curva est�ndar a partir del SRI, diluidas en soluci�n de anticuerpos. Las placas se incubaron 1 h a temperatura ambiente y se lavaron posteriormente de la forma descrita. Luego se adicion� 100 μL/pocillo del anticuerpo anti-IgG humano conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich, EUA) preparado en soluci�n de anticuerpos. Las placas se incubaron nuevamente 2 h a temperatura ambiente y m�s tarde se lavaron de la forma descrita. Posteriormente, se aplicaron 100 μL de la disoluci�n cromog�nica p-nitrofenil fosfato hexahidratado (0,5 mg/mL), diluida en tamp�n sustrato (dietanolamina, MgCl₂*6H₂O, HCl 6M, pH 9,8 � 0,05). La reacci�n se desarroll� durante 30 min a temperatura ambiente, protegida de la luz y se detuvo con 50 μL/pocillo de NaOH 3M. Las lecturas se realizaron en un lector de microplacas (TECAN, Austria) acoplado a una computadora haciendo uso del programa Magellan 7; la absorbancia se midi� con una longitud de onda de 405nm con 690nm de referencia.

Determinaci�n del rango lineal de la curva y titulaci�n del conjugado

Se realizaron tres ensayos en los que se evaluaron 12 diluciones seriadas con factor 3 del SRI 06/142 del NIBSC, comenzando desde 1/100. En cada ensayo se procesaron seis r�plicas de cada suero. Se seleccion� el segmento de la curva correspondiente a aquellas diluciones que alcanzaran un coeficiente de determinaci�n (R²) ≥ 0,98, un coeficiente de correlaci�n (r) ≥ 0,99, as� como un coeficiente de variaci�n (CV) menor del 10% entre las concentraciones de cada punto, una vez corregidas por el factor de diluci�n. Los par�metros de la ecuaci�n se determinaron mediante regresi�n no lineal polin�mica. El CV debe ser menor del 20% para los tres ensayos realizados.⁽⁹⁾ El SRI recibi� una asignaci�n arbitraria de 100 unidades arbitrarias por mililitro (UA/mL), para su empleo como curva de calibraci�n.

La diluci�n del anticuerpo anti-IgG humano conjugado a fosfatasa alcalina se titul� igualmente en diluciones entre 1:10.000 y 1:20.000, con incrementos de 5.000 con las mismas curvas del SRI. Se seleccion� como diluci�n �ptima aquella cuya raz�n suero positivo/suero negativo fue mayor.

Precisi�n del ensayo

Precisi�n intraensayo

La repetibilidad del ensayo se evalu� utilizando tres sueros de diferentes concentraciones dentro del rango de la curva est�ndar, a trav�s del an�lisis de cinco r�plicas. Se determinaron la media, la desviaci�n est�ndar (DS) y el CV. Para considerar la precisi�n intraensayo como adecuada, el coeficiente de variaci�n no debe superar el 10% entre las determinaciones realizadas.⁽⁹⁾

Precisi�n interensayo

La precisi�n interensayo se evalu� con los sueros referidos en el ac�pite anterior, por duplicado, en cuatro diluciones dobles seriadas. La evaluaci�n se realiz� bajo las condiciones de: un analista en d�as diferentes, tres analistas en un mismo d�a y entre dos laboratorios y se utilizaron las mismas soluciones y equipos excepto cuando se realiz� en el otro laboratorio. La temperatura durante el ensayo se mantuvo en un rango de 18�C a 24�C. Para cumplir con este par�metro, el CV no debe superar el 20% para cada uno de los casos.⁽⁸⁾

Paralelismo

Se procesaron en el mismo ensayo, dos r�plicas de cada punto de la curva de calibraci�n a las diluciones previamente seleccionadas, con al menos seis r�plicas de cuatro diluciones de suero, desde 1/100 hasta 1/800, de siete muestras procedentes de ni�os previamente vacunados. Se calcul� el R² de cada curva obtenida que debe ser ≥ 0,98, as� como el CV entre las concentraciones de cada muestra, una vez corregidas por el factor de diluci�n, que debe ser inferior al 10%.⁽⁹⁾

Valor de corte y l�mite de detecci�n

Para establecer el valor de corte y l�mite de detecci�n se utilizaron los sueros positivos y negativos (sueros positivos a t�tano y difteria) como se describe en el ac�pite anterior. El l�mite de detecci�n se calcul� como la media de la respuesta de anticuerpos de las muestras de sueros no relacionadas m�s tres veces la DS expresada en UA/mL.

Especificidad

Para determinar la especificidad de la t�cnica, se evaluaron sueros humanos inmunizados con diferentes inmun�genos: c�lulas enteras de B. pertussis, toxoide tet�nico (TT) y toxoide dift�rico (TD) con una concentraci�n conocida de anticuerpos en cada caso. El criterio de aceptaci�n fue que los sueros positivos para otros ant�genos resultaran no respondedores para B. pertussis seg�n el criterio seleccionado anteriormente.⁽⁹⁾

Aplicaci�n del ELISA en Ensayos Cl�nicos

Para evaluar el uso del ELISA, se determinaron las concentraciones de anticuerpos contra B. pertussis en sueros de ni�os procedentes del Ensayo Fase II/III �Evaluaci�n de la inmunogenicidad y eficacia del candidato vacunal heptavalente contra neumococos en ni�os pre-escolares (ISCANI, RPCEC00000182)�; este candidato vacunal en estudio se aplic� de manera concomitante con otras vacunas del calendario nacional de vacunaci�n. Se evaluaron dos grupos etarios comprendidos entre 12-23 meses y 2-5 a�os.

Resultados y Discusi�n

Las vacunas de c�lulas enteras contra B. pertussis han sido utilizadas desde 1940 con cierto �xito en el control de la tos ferina. Por su reactogenicidad, fueron sustituidas en algunos esquemas de inmunizaci�n por las vacunas acelulares. A pesar de ello, el microorganismo sigue re-emergiendo, aun cuando existe alta cobertura y esquemas de inmunizaci�n eficientes a nivel mundial. Las causas de esta re-emergencia son multifactoriales por lo que se impone la necesidad de evaluar continuamente el estado serol�gico de las poblaciones pedi�tricas.⁽¹⁰⁾

Los ensayos inmunoenzim�ticos ELISA han sido extensamente utilizados en estudios inmunoepidemiol�gicos de B. pertussis. Estos ensayos se realizan con frecuencia mediante la evaluaci�n directa de los anticuerpos espec�ficos contra la toxina pertussis relacionada estrechamente con la protecci�n.⁽¹¹⁾ Adicionalmente, el seguimiento y evaluaci�n de la respuesta de anticuerpos contra la c�lula entera constituye una herramienta necesaria como diagn�stico y evaluaci�n de la inmunogenicidad vacunal.⁽¹²⁾ �Estos ensayos permitir�an adem�s determinar y caracterizar la respuesta de anticuerpos espec�ficos en esquemas de vacunaci�n combinados o concomitantes con vacunas como la anti-neumococica.

Recubrimiento

En la Figura 1 se puede apreciar una curva sigmoidal con un ligero ascenso de las concentraciones de recubrimiento. En este caso se escogi� 0,5 UO/mL de c�lulas enteras de B. pertussis, donde se alcanz� la mayor se�al posible con el menor valor de blanco y se comienza a observar un discreto ascenso de la respuesta, ya que cualquier concentraci�n superior de ant�geno no proporcionar� una respuesta superior.

Fig. 1. Determinaci�n de la concentraci�n de recubrimiento de c�lulas enteras de B. pertussis (UO/mL). D.O: densidad �ptica.

Establecimiento del rango lineal de la curva y el t�tulo del conjugado

Al evaluar la diluci�n adecuada del anticuerpo anti IgG humana conjugado a fosfatasa, se determin� que la mayor relaci�n entre el suero control positivo y el suero control negativo se observ� con la diluci�n 1:10.000.

Luego de evaluar 12 diluciones seriadas triples del suero de referencia se escogi� el segmento de la curva comprendido entre 1/100 y 1/72.900 por ser el segmento que mejor ajuste mostraba con una curva polin�mica de grado 3 con un coeficiente de determinaci�n R² de 0,994 y coeficiente de correlaci�n (r) de 0,995 (Fig. 2). El suero est�ndar diluci�n 1/100 recibi� una asignaci�n arbitraria de 100 UA/mL para su empleo como curva est�ndar.

Fig. 2. Curva de calibraci�n del ELISA de cuantificaci�n de anticuerpos contra c�lulas enteras de B. pertussis. Se grafica la densidad �ptica (D.O) contra el logaritmo del inverso de la diluci�n del intervalo seleccionado. El valor promedio de las determinaciones de las curvas realizadas en d�as diferentes se muestra en l�nea continua. Las l�neas discontinuas representan el valor promedio � 2 desviaciones est�ndar (DS).

Precisi�n

Precisi�n intraensayo

La precisi�n intraensayo es el par�metro que se utiliza para evaluar la variabilidad intr�nseca del m�todo. Es llevada a cabo sobre la base de un n�mero suficiente de determinaciones, en las mismas condiciones, por un mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos; generalmente en un corto intervalo de tiempo.

En la Tabla 1 se muestran los CV para tres r�plicas de cada muestra, siendo estas menores del 10%, por lo tanto, el ensayo posee una variabilidad intr�nseca aceptable.⁽⁹⁾ Esto significa que el m�todo posee una buena precisi�n entre determinaciones independientes realizadas en las mismas condiciones.

Tabla 1. Precisi�n intraensayo.

Muestras	r�plica 1	R�plica 2	R�plica 3	Promedio	Ds	CV
1	111,351	113,307	112,329	112,329	0,978	0,871
2	64,675	62,930	63,803	63,803	0,873	1,367
3	1,339	1,208	1,376	1,308	0,088	6,750
DS: desviaci�n est�ndar. CV: coeficiente de variaci�n.

Precisi�n interensayo

La reproducibilidad es la medida de la precisi�n de los resultados de un m�todo anal�tico que se efect�a sobre la misma muestra, pero en condiciones diferentes: analistas, laboratorios, equipos y d�as, entre otras. Es decir, eval�a la variabilidad debida a un factor extr�nseco al m�todo.⁽¹³⁾ En la Tabla 2 se muestran las medias de las concentraciones obtenidas para cada una; el CV interensayo para todos los casos fue inferior al 20%. De acuerdo con estos resultados puede afirmarse que el m�todo posee una reproducibilidad satisfactoria.⁽¹³⁾

Tabla 2. Precisi�n interensayo.

Paralelismo

Se evalu�, adem�s, el paralelismo entre la respuesta de la curva de calibraci�n y la obtenida en sueros de ni�os participantes en el Ensayo ISCANI. Los sueros individuales de cada sujeto fueron evaluados para medir la respuesta espec�fica contra B. pertussis. En la Figura 3 se muestran los valores promedios de cada suero con respecto a la curva de calibraci�n obtenida a partir del SRI. En todos los casos los R² obtenidos fueron superiores a 0,98 y el CV entre las concentraciones de cada muestra fue inferior al 10%, una vez corregido los valores obtenidos por el factor de diluci�n, lo que avala la linealidad de la respuesta.⁽⁹⁾

Fig. 3. Paralelismo. Respuesta de IgG de c�lulas enteras de B. pertussis. Se grafican los valores de densidad �ptica (D.O) de IgG en funci�n de los logaritmos de las diluciones.

L�mite de detecci�n

El l�mite de detecci�n calculado fue de 0,04 UA/mL. Los sueros negativos con valores asignados para otros ant�genos no relacionados presentaron valores de respuesta bajos, inferiores al l�mite de detecci�n. Las muestras de los sueros no relacionados que resultaron negativas se encontraron por debajo del l�mite de detecci�n, por lo que este tambi�n se convierte en el valor de corte del ensayo. Dado este valor los sujetos con valores por encima del mismo ser�n considerados respondedores.

Especificidad

La especificidad se define como la capacidad del ensayo para identificar o medir el analito en una muestra en presencia de otros componentes previsibles en el producto (impurezas, productos de degradaci�n, otros componentes de la formulaci�n). Este criterio define la propiedad del m�todo de detectar el anticuerpo de inter�s, sin que otros anticuerpos afecten o influyan sobre el valor obtenido. Se puede determinar adicionando a la muestra una cantidad conocida de impurezas en concentraciones adecuadas y demostrar que el an�lisis no resulta afectado por la adici�n de estas sustancias.⁽¹⁴⁾ Para la determinaci�n de la especificidad se evaluaron sueros humanos inmunizados contra c�lulas enteras de B. pertussis, incluyendo otros positivos a TT y dift�rico TD.

En la Figura 4A se observan los valores de las D.O de los sueros que se evaluaron. Los dos sueros negativos no relacionados presentaron respuestas bajas en todos los casos, estad�sticamente significativas (p=0,002), con respecto al suero control positivo contra B. pertussis. La absorbancia del suero positivo contra c�lulas enteras de B. pertussis fue superior a la de los sueros espec�ficos para otros ant�genos. Lo que demuestra que el ensayo cuantifica los anticuerpos anti c�lulas completas de B. pertussis sin que los valores sean afectados por la presencia de interferencias en el suero.

Aplicaci�n del Ensayo

En el ensayo se utilizaron sueros de 200 ni�os participantes en el Ensayo ISCANI, del candidato vacunal cubano contra neumococo PCV7-TT. En la Figura 4B se muestran las medias geom�tricas de las concentraciones calculadas para cada grupo etario evaluado, el grupo comprendido de 12-18 meses mostr� valores de anticuerpos m�s altos que los encontrados en el grupo de 2-5 a�os. La inmunizaci�n de refuerzo de c�lulas enteras de B. pertussis que recibe la poblaci�n infantil a los 12 y 18 meses pudiera ser la raz�n del por qu� los t�tulos de anticuerpo son superiores, los cu�les van decayendo en el tiempo y por esto se ve una disminuci�n en el grupo de 2-5 a�os.

Fig. 4. Especificidad y aplicaci�n del ELISA de cuantificaci�n en ensayos cl�nicos. A) Pertussis (suero positivo contra c�lulas enteras de B. pertussis), T�tanos (suero positivo contra TT) y Difteria (suero positivo contra TD). B) Se observan las medias geom�tricas de las concentraciones de los sueros procedentes del ensayo ISCANI. Las barras de error corresponden a las desviaciones est�ndar calculadas. D.O: densidad �ptica.

Conclusiones

El ELISA de cuantificaci�n permitir� determinar de manera precisa y espec�fica los anticuerpos IgG inducidos por la vacuna de c�lulas enteras de B. pertussis.

Referencias

1. Keech C, Miller V, Rizzardi B, Hoyle C, Pryor MJ, Ferrand J, et al. Inmunogenicity and safety of BPZE1, an intranasal live attenuated pertussis vaccine, versus tetanus-diphtheria-acellular pertussis vaccine: a randomised, double-blind, phase 2b trial. Lancet. 2023; 401:843-55. doi: https://10.1016/S0140-6736(22)02644-7.

2. Carbonetti NH. Contribution of pertussis toxin to the pathogenesis of pertussis disease. Pathog Dis. 2015;73(8):ftv073. doi: https://10.1093/femspd/ftv073.

3. World Health Organization (WHO). Pertussis Vaccines: WHO Position Paper. Ginebra: WHO; 2015. Disponible en: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-WER9035. (Consultado en l�nea: 10 de abril de 2023).

4. Locht C. The Path to New Pediatric Vaccines against Pertussis. Vaccines. 2021;9(3):228. doi: https://10.3390/vaccines9030228.

5. Gambhir M, Clark TA, Cauchemez S, Tartof SY, Swerdlow DL, Ferguson NM. A Change in Vaccine Efficacy and Duration of Protection Explains Recent Rises in Pertussis Incidence in the United States. PLoS Comput Biol. 2015;11(4): e1004138. doi: https://10.1371/journal.pcbi.1004138.

6. Reed G, Galindo MA. Cuba's National Immunization Program. MEDICC review. 2007;9(1):5-7. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/4375/437542063002.pdf. (Consultado en l�nea: 8 de abril de 2023).

7. Sharma H, Yadav S, Lalwani S, Kapre S, Jadhav S, Parekh S, et al. Antibody persistence of two pentavalent DTwP-HB-Hib vaccines to the age of 15-18 months, and response to the booster dose of quadrivalent DTwP-Hib vaccine. Vaccine. 2013;31(3):444-7. doi: https://10.1016/j.vaccine.2012.11.038.

8. Ochoa R, Mart�nez JC, Ferriol X, Estrada E, Garc�a AM, Blanco R, et al. Gu�a para la estandarizaci�n de t�cnicas inmunoenzim�ticas en ensayos de vacunas. Vaccimonitor. 2000;9(3):13-8. Disponible en: http://scielo.sld.cu/pdf/vac/v9n3/vac033000.pdf. (Consultado en l�nea: 24 de marzo del 2023).

9. Mandiarote-Llanes A, Guti�rrez N, Valmaseda-P�rez T, Sosa R, Ontivero I, Talavera-Coronel A, et al. Estandarizaci�n de ensayos inmunoenzim�ticos (ELISA) para la cuantificaci�n de anticuerpos IgG inducidos por una vacuna de ves�culas de membrana externa de los serogrupos A y W135 de Neisseria meningitidis. Vaccimonitor. 2012;21(2):16-23. Disponible en: https://vaccimonitor.finlay.edu.cu/index.php/vaccimonitor/article/view/68. (Consultado en l�nea: 10 de marzo de 2023).

10. van der Lee S, Hendrikx LH, Sanders EAM, Berbers GAM, Buisman AM. Whole-Cell or Acellular Pertussis Primary Immunizations in Infancy Determines Adolescent Cellular Immune Profiles. Front Immunol. 2018; 9:51. doi: https://10.3389/fimmu.2018.00051.

11. Riffelmann M, Thiel K, Schmetz J, Wirsing von Koenig CH. Performance of commercial enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to Bordetella pertussis. J Clin Microbiol. 2010;48(12):4459-63. doi: https://10.1128/JCM.01371-10.

12. van der Zee A, Schellekens JF, Mooi FR. Laboratory Diagnosis of Pertussis. Clin Microbiol Rev. 2015;28(4):1005-26. doi: https://10.1128/CMR.00031-15.

13. Ochoa R. T�cnicas inmunoenzim�ticas para ensayos cl�nicos de vacunas y estudios inmunoepidemiol�gicos. La Habana: Finlay Ediciones; 2012.

14. CECMED. Anuario Cient�fico CECMED 2019. La Habana: CECMED; 2019. Disponible en https://www.cecmed.cu/sites/default/files/adjuntos/anuario/CECMED2019%20r.pdf. (Consultado en l�nea: 8 de abril de 2023).

Conflicto de Intereses

Los autores no declaran conflictos de intereses.

Roles de autor�a

Dayle Mart�nez-Bedoya: lider� la investigaci�n, estableci� sus objetivos y dise�o, particip� en el an�lisis de los datos del estudio, ejecuci�n de la investigaci�n y en la elaboraci�n del art�culo.

Rocmira P�rez-Nicado: lider� la investigaci�n, estableci� sus objetivos y dise�o, particip� en el an�lisis de los datos del estudio, ejecuci�n de la investigaci�n y en la elaboraci�n del art�culo.

Samantha Fern�ndez-Gonz�lez: estableci� sus objetivos y dise�o, particip� en el an�lisis de los datos del estudio, ejecuci�n de la investigaci�n y en la elaboraci�n del art�culo.

Yamilka Soroa-Mill�n: particip� en el dise�o, ejecuci�n de la investigaci�n.

Yisabel Aranguren-Mazorra: supervisi�n y revisi�n de la escritura del manuscrito.

Ayl�n Amador-G�mez: ejecuci�n de la investigaci�n

Laura M. Rodr�guez-Noda: responsabilidad de gesti�n y coordinaci�n de la planificaci�n y ejecuci�n de la actividad de investigaci�n

Dagmar Garc�a-Rivera: responsabilidad de supervisi�n y liderazgo en la planificaci�n y ejecuci�n de actividades de investigaci�n.

Todos los autores revisaron y aprobaron la versi�n final de este manuscrito.

* Lic. Bioqu�mica y Biolog�a Molecular. Aspirante a Investigador. Instituto Finlay de Vacunas. La Habana, Cuba.

^** Lic. Biolog�a, Investigadora agregada. Investigador Agregado. Instituto Finlay de Vacunas. La Habana, Cuba.