Influencia de la procedencia de los componentes del medio de cultivo en la calidad de los ensayos microbiolgicos para la determinacin de bacterifagos

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Influencia de la procedencia de los componentes del medio de cultivo en la calidad de los ensayos microbiolgicos para la determinacin de bacterifagos

 

Influence of the origin of the components of the culture medium on the quality of the microbiological assays for the determination of bacteriophages

 

 

Annia Gonzlez-Crespo, Angela E. Sosa-Espinosa*

Laboratorio Coleccin Central de Microorganismos. Direccin de Seguridad y Proteccin. Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa. Ave 31 entre 158 y 190. Cubanacn. Playa. La Habana. Cuba.

 

email: angela.sosa@cigb.edu.cu

* Licenciada en Biologa, Master en Microbiologa, Investigador auxiliar. Especialista Principal de Seguridad biolgica, qumica, radiolgica y salvaguardia. Jefa del Laboratorio Coleccin Central de Microorganismos.

 


RESUMEN

La contaminacin por virus bacterianos es uno de los problemas ms difciles de evaluar en la industria biotecnolgica moderna, sobre todo en las producciones de protenas que estn basadas en cepas recombinante de Escherichia coli. Para certificar que un banco de cepas est libre de bacterifagos el mtodo ms recomendado sigue siendo la induccin de la fase del ciclo ltico sobre placas con medios semislidos. En este trabajo nos propusimos evaluar medios de cultivos elaborados con bases de diferentes casas comerciales para la deteccin de bacterifagos contaminantes. Para ello utilizamos un aislado de bacterifago ambiental y la cepa sensible LE 392 y bases de las firmas OXOID, BioCen y Biolife. Despus de estandarizar la metodologa de ensayo se evalu la habilidad de una preparacin concentrada del aislado ambiental de formar placas de lisis en los medios elaborados con reactivos de las tres casas comerciales. La mayor cantidad de placas de lisis se obtuvo cuando se emplearon las bases provenientes del Centro Nacional de Biopreparados, el medio donde menos placas de lisis observamos fue empleando bases proveniente de la Casa comercial Biolife con dos rdenes de magnitud menos. El medio preparado con bases provenientes de la casa comercial OXOID fue el que mostr mejor consistencia entre lotes.

Palabras clave: bacterifagos, contaminacin, medios de cultivo.


ABSTRACT

Contamination by bacterial viruses is one of the most difficult problems to evaluate in the modern biotechnology industry, especially in the productions of recombinant proteins that are based on Escherichia coli strains. To certify that a strain bank is free of bacteriophage, the most recommended method is still the induction of the lytic cycle phase on plates with semisolid media. In this work we set out to evaluate means of cultures made with bases of different commercial houses for the detection of contaminating bacteriophages. For this purpose we used an environmental bacteriophage isolate and the LE392 sensitive strain and bases of the firms OXOID, BioCen and Biolife. After standardization of the test methodology, the ability of a concentrated preparation of the environmental isolate to form lysis plates in the media made with reagents from the three commercial houses was evaluated. The largest number of lysis plates was obtained when using the bases from the National Center of Biopreparates, the means where less lysis plates were observed was using bases from the Biolife Commercial House with two orders of magnitude less. The medium prepared with bases from the commercial house OXOID was the one that showed better lot to lot consistency.

Keywords: bacteriophages, contamination, culture media.


 

INTRODUCCIÓN

El control de calidad de bancos de las cepas de E. coli utilizadas en las metodologas de la Biotecnologa moderna incluye la verificacin de contaminantes ambientales (1). De estos la contaminacin por bacterifagos es de las ms difciles de evaluar (2). Los bacterifagos son virus capaces de infectar las bacterias y no son detectables por las tcnicas clsicas que se emplean en microbiologa para el recuento de contaminantes ambientales. Dentro de los mtodos de evaluacin de la microbiologa ambiental en las reas no hay descrito una forma normalizada de evaluacin de la presencia de estas entidades microbianas (3).

E. coli es sensible a una gran variedad de bacterifagos. Sin embargo, los diferentes aislamientos y sus derivados tienen una susceptibilidad diferente a la infeccin por fagos lo que hace que los mtodos moleculares, aunque ms sensibles, no puedan ser empleados a menos que se conozcan todos los subtipos de bacterifagos en el rea y la capacidad de estos de infectar las cepas de un proceso biotecnolgico determinado (4). La determinacin de la concentracin de partculas infecciosas de fago sobre un csped de bacterias sensibles en placa con medio agarizado sigue siendo el protocolo recomendado para el trabajo con estos virus (5).

La formacin de las placas de lisis es un proceso que no est explicado totalmente. El desarrollo de los bacterifagos y la habilidad de la formacin de placas de lisis se han relacionado, entre otros, factores con la fisiologa de la clula bacteriana y la relacin de concentracin fago bacteria (6). Por lo tanto, la eleccin del medio de cultivo para determinar la presencia de bacterifagos en una muestra ambiental puede influir en la visualizacin de las placas de lisis provocando la liberacin o el rechazo por criterios de calidad de bancos contaminados con estas entidades microbiolgicas. En estudios anteriores nosotros encontramos una gran variabilidad entre reas que empleaban un mismo lisado como control del mtodo de determinacin de la presencia o no de fagos en sus procesos, a pesar de emplear la misma metodologa. En el anlisis de los resultados solo encontramos diferencia en los proveedores de los componentes de los medios de cultivo. Por este motivo, hemos realizado un estudio comparativo de tres proveedores de medios de cultivo con el objetivo de analizar su influencia en la metodologa de deteccin de bacterifagos para la liberacin de bancos de cepas o procesos fermentativos basado en cepas de E. coli.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Para el estudio se emple la cepa de E. coli sensible a bacterifagos LE392 con genotipo glnV44 supF58 (lacY1 o ΔlacZY) galK2 galT22 metB1 trpR55 hsdR514 (rK-mK+) provenientes de la Coleccin Central de Microorganismos del Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa. El medio de cultivo LB se utiliz para el crecimiento bacteriano en lquido (7). El mismo medio, pero suplementado con agar bacteriolgico 15 g/L, se emple para el crecimiento bacteriano en placas con medio slido.

Para la obtencin y titulacin de lisados fgicos se emple agar blando (10 g/L de triptona, 2,5 g/L de NaCl y agar bacteriolgico 6 g/L). Todos los medios empleados para el establecimiento de la metodologa se prepararon con componentes de la misma casa comercial. Evaluamos primeramente OXOID, se pes para preparar medio de cultivo LB 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCl y para obtener LB slido se adicion agar bacteriolgico 15 g/L, para el agar blando se pes triptona 10 g/L, NaCl 2,5 g/L y agar 6 g/L. Cuando evaluamos Biolife y BioCen fueron pesadas estas mismas cantidades. Se evaluaron tres lotes diferentes de cada casa comercial.

Metodologa para evaluacin de la influencia de la fisiologa de la cepa en el ttulo del fago

Empleando los medios elaborados con los diferentes proveedores se evalu la influencia del estado fisiolgico del cultivo en la formacin de placas de lisis. Para ello inoculamos la cepa a infectar en 5 mL de LB y se incub a 37C toda la noche, luego se infect con el lisado de fago, se adicion el agar blando, se verti en las placas de LB y se incubaron a 37C hasta la aparicin de las placas de lisis. Un segundo ensayo consisti en inocular la cepa a infectar en 5 mL de LB e incubar a 37C toda la noche. De este cultivo se inocularon 5 mL en medio lquido LB, se incub en agitacin a 180 rpm y 37C hasta el inicio de la fase estacionaria (aproximadamente 6 h). Este cultivo se infect con el lisado de fago. Luego se adicion el medio agar blando, se verti en placas que contenan medio LB y se incubaron a 37C hasta la aparicin de las placas de lisis. Ensayo de la adicin de sales trazas al medio de cultivo. Todos los ensayos se llevaron a cabo adicionando a los medios preparados 3 mL por litro de una solucin de sales trazas (TES) que contiene: CaCL2 anidro (0,5 g/L), ZnSO4 x 7H2O (0,18 g/L), MnSO4 x H2O (0,1 g/L), FeCl3 (8,35 g/L), CuSO4 x 5H2O (0,1 6g/L) y CoCL2 x 6H2O (0,18 g/L) (8) independientemente de la casa comercial de los componentes que se emplearon para cada ensayo.

Metodologa para evaluacin de la habilidad de formacin de placas de lisis de bacterifagos en medios con componentes de diferentes proveedores

Los cultivos se inocularon en tubos de precultivos que contenan 5 mL del medio LB preparados con reactivos de las casas comerciales OXOID, Biolife y BioCen y se incubaron con agitacin a 37C durante toda la noche. A partir de este cultivo se inocularon 0,1 mL en un precultivo LB y se incub en las mismas condiciones durante 6 h. Se realizaron diluciones seriadas 1/10 hasta 10-7 de un lisado de fago. En tubos eppendorf de 5 mL se aadieron 0,1 mL del cultivo de LE392 crecido durante 6 h y 0,1 mL de las diluciones del lisado de bacterifagos. Despus de mezclar se incub a 37C durante 30 min. Luego de este tiempo se aadieron 5 mL de medio agar blando fundido a 42C y se vertieron sobre placas con medio LB. Las placas se incubaron a 37C entre 16-24 h. Pasado este tiempo se determin el nmero de Ufp/mL, donde Ufp/mL= # de placas x dilucin x 10. Se realizaron 3 rplicas. La Figura 1 muestra la estrategia general seguida.

 

RESULTADOS Y DISCUSIN

Una de las verificaciones necesarias en los bancos de las cepas de E. coli de inters biotecnolgico es la comprobacin de la pureza con relacin a los posibles contaminaciones con bacterifagos provenientes de diferentes fuentes ambientales. De esta forma se evita el paso de contaminantes muy difciles de detectar a las producciones a gran escala. Para certificar que un banco est libre de fagos con fase de ciclo ltico es necesario inducir la lisis sobre un csped de una cepa sensible. En nuestros ensayos de rutina en el laboratorio observamos que existan incongruencias con relacin a lisados de bacterifagos aislados del ambiente cuando cambibamos de lote de medio de cultivo o de proveedor. En el establecimiento del ensayo, comprobamos que no siempre se obtenan los mismos resultados con un lisado de bacterifagos aislados del ambiente cuando se cambiaban los lotes de medios de cultivo, por lo que la evaluacin inicial del proveedor es esencial para la estandarizacin del mtodo de determinacin de bacterifagos.

En base a esta observacin evaluamos medios de cultivos elaborados con componentes de tres casas comerciales diferentes: OXOID, BioCen y Biolife, como nica diferencia en el ensayo para la deteccin de bacterifagos contaminantes en bancos de cepas de E. coli. Para ello utilizamos un lisado de fago ambiental con ttulo de 105 unidades formadoras de placas por mL (Ufp/mL) y la cepa LE 392 sensible a la infeccin por fago. Bajo las mismas condiciones de ensayo se evalu la habilidad de formar placas de lisis de la preparacin concentrada del aislado de bacterifagos sobre csped de la cepa LE 392 en la superficie de placas de medio LB elaborados con bases de las tres casas comerciales OXOID, BioCen y Biolife. Los mayores por ciento de infeccin se obtuvieron con los lotes de bases provenientes del BioCen donde se detect el mayor conteo de placas de lisis con 2 x 105 Ufp/mL, el medio donde menos placas de lisis observamos fue en el Biolife (Fig. 2). Sin embargo, la mejor reproducibilidad entre lotes se encontr en medios preparados con reactivos de la casa comercial OXOID.

 

REFERENCIAS

1. Prez-Reytor DC, Domnguez-Vzquez I, Olano-Ruiz E, Sosa-Espinosa AE. Estrategia de verificacin de calidad de las cepas de Escherichia coli conservadas en la Coleccin del Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa. Vaccimonitor 2010;19(1):9-15.

2. Marc MB, Moineau S, Quiberoni A. Bacteriophages and dairy fermentations. Bacteriophage 2012;2(3):149-58.

3. Los M. Minimization and prevention of phage infections in bioprocesses. In: Cheng Q. (eds) Microbial Metabolic Engineering: Methods and Protocols, vol 834. New York: Springer; 2012. p:305-15.

4. Jorquera D, Galarce N, Borie C. El desafo de controlar las enfermedades transmitidas por alimentos: bacterifagos como una nueva herramienta biotecnolgica. Revista chilena de infectologa, 2015;32(6):678-88.

5. Lpez Salguero DC. Bacterifagos como alternativa para eliminar cepas de Acinetobacter baumannii resistente a antibiticos presentes en tres hospitales del Ecuador. [Tesis doctoral]. Quito: Universidad Internacional SEK; 2015.

6. Espinel CF, Dominick VF, Morillo MM. Aislamiento y caracterizacin del bacterifago Va1 especfico a Vibrio alginolyticus. Revista Peruana de Biologa 2017;24(1):93-100.

7. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual: second edition. Cold Spring Harbor New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.

8. Wilms B, Hauck A, Reuss M, Syldatk C, Mattes R, Siemann M, Altenbuchner J. High cell density fermentation for production of LNcarbamoylase using an expression system based on the Escherichia coli rhaBAD promoter. Biotechnology and Bioengineering 2001;73(2):95-103.

9. Gonzlez N, Zamora J, Prez C, Salazar E, Prez E, Pimentel E, Expsito M. Incremento en la conversin del medio de cultivo en biomasa en la fermentacin de Corinebacterium paurometabolum. Revista Cubana de Qumica, 2005;17(1):154-5.

10. Wilkinson BJ, Hindahl MS, Galbraith L, Wilkinson SG. Lipopolysaccharide of Paracoccus denitrificans ATCC13543. FEMS Microbiology Letters 1986;37(1):63-67.

11. Papp-Wallace K, Maguire M. Magnesium Transport and Magnesium Homeostasis. EcoSal Plus 2008; 3(1): doi: 10.1128/ecosalplus.5.4.4.2.

 

Recibido: Septiembre de 2017              Aceptado: Octubre de 2017

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