Evaluacin de un antgeno de Brucella abortus para aglutinacin en placa como prueba tamiz en el diagnstico de la brucelosis bovina

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Evaluacin de un antgeno de Brucella abortus para aglutinacin en placa como prueba tamiz en el diagnstico de la brucelosis bovina

 

Evaluation of a Brucella abortus antigen for plaque agglutination as screening test in the diagnosis of bovine brucellosis

 

 

David Rajme-Manzur*, Marian Hernndez-Reyes, Meilyn Cruz-Soca, Leslie Padron-Fajardo

Grupo Empresarial LABIOFAM. Empresa Productora de Vacunas Virales y Bacterianas (EPVVB). Ave. Independencia, Km. 16 CP. 17200. Boyeros, La Habana, Cuba.

 

email: drajme@nauta.cu

* Doctor en Medicina Veterinaria y Zootecnia. Especialista en Producciones Biofarmacuticas.

 


RESUMEN

Este trabajo tuvo como objetivo obtener y validar un antgeno buferado de Brucella abortus para la prueba de aglutinacin en placa como prueba diagnstica de base de la brucelosis bovina. Se formularon tres lotes de antgeno a partir de la multiplicacin de la cepa 99 de Brucella abortus. Se realizaron los controles de calidad correspondientes (determinacin de pH, volumen celular, esterilidad, capacidad buferante) y las pruebas serolgicas para la evaluacin del desempeo. Se emplearon 1070 muestras de suero bovino (350 positivas y 720 negativas) previamente controladas con las pruebas de diagnstico establecidas. Se determin la sensibilidad y especificidad diagnstica y relativa, los valores predictivos positivos y negativos, la eficacia y la concordancia. En los tres lotes todas las caractersticas evaluadas resultaron estar dentro de los parmetros establecidos para este tipo de producto. La especificidad y sensibilidad diagnsticas fueron de 99,5% y 100% respectivamente. El valor predictivo positivo fue de 99,1%, el valor predictivo negativo fue de 100% y la eficacia de un 99,7%. El antgeno mostr una sensibilidad y especificidad relativas de un 100% y la concordancia result ser clasificada como muy buena. La evaluacin del desempeo arroj resultados satisfactorios, demostrando que el mtodo de produccin empleado es factible para la obtencin de un producto con adecuada eficacia.

Palabras clave: Brucella abortus, aglutinación en placa, brucelosis.


ABSTRACT

The objective of this work was to obtain and validate a buffered Brucella abortus antigen for plaque agglutination test as the basic diagnostic test for bovine brucellosis. Three batches of antigen were formulated from the multiplication of strain 99 of Brucella abortus. Quality controls (determination of pH, cell volume, sterility, buffering capacity) and serological tests for performance evaluation were performed. 1070 bovine serum samples (350 positive and 720 negative) previously tested with the established diagnostic tests were used. Diagnostic and relative sensitivity and specificity, positive predictive values and negative predictive values, efficacy and concordance were determined. In all lots the evaluated characteristics proved to be within the parameters established for this type of product. Diagnostic specificity and sensitivity were 99.5% and 100%, respectively. The positive predictive values was 99.1%, the negative predictive values was 100% and the efficacy was 99.7%. The antigen showed a relative sensitivity and specificity of 100% and the concordance was classified as very good. The performance evaluation showed satisfactory results, demonstrating that the production method used is feasible to obtain a product with adequate efficiency.

Keywords: Brucella abortus, plaque agglutination test, brucellosis.


 

INTRODUCCIÓN

La brucelosis es una enfermedad infectocontagiosa de origen bacteriano y carcter zoontico, producida por microorganismos del gnero Brucella (1). Este agente biolgico es una bacteria Gram negativa con un lipopolisacrido (LPS) fuertemente inmunodominante, lo que junto a la capacidad de sobrevivir en el interior de clulas fagocticas constituyen sus principales factores de virulencia (2). La infeccin en bovinos es generalmente causada por Brucella abortus, Brucella melitensis y Brucella ovis que afectan principalmente a pequeos rumiantes.

Las especies B. abortus y B. melitensis se transmiten generalmente entre animales por contacto con la placenta, lquidos fetales y las descargas vaginales de un animal infectado. Los animales eliminan brucelas despus de un aborto o de un parto a trmino. Aunque los rumiantes generalmente no presentan sntomas despus de su primer aborto, pueden convertirse en portadores crnicos y continuar eliminando grmenes en la leche y en las descargas uterinas durante las preeces posteriores (3, 4). La enfermedad se caracteriza por la presentacin de abortos, retencin placentaria, orquitis, epididimitis e infertilidad, lo cual se traduce en graves daos econmicos debido a las prdidas de terneros y disminucin en la produccin de leche.

El diagnstico clnico no es de gran utilidad ya que no hay signos patognomnicos, en general, el aborto se produce en varios animales y son necesarias las pruebas de laboratorio para confirmar la presencia del agente etiolgico (5). Las pruebas serolgicas dan una evidencia indirecta de la infeccin bruclica, ya que cuando son efectuadas en forma uniforme y se interpretan con criterio epidemiolgico, constituyen el instrumento ms prctico para el diagnstico. Existen numerosas pruebas para el diagnstico serolgico de brucelosis. Estratgicamente se utilizan de inicio pruebas de alta sensibilidad (tamiz) y luego las confirmatorias de menor sensibilidad, pero ms especficas (6). Ninguna prueba serolgica aislada es adecuada en cualquiera de las situaciones epidemiolgicas, presentando limitaciones en el diagnstico de animales individuales. Se deben considerar todos los factores que influyen en la relevancia del mtodo de prueba y de sus resultados para una aplicacin o interpretacin diagnstica especfica (7, 8). Se ha planteado que para el control de la brucelosis en un pas o regin, son adecuadas para el pesquisaje las pruebas con antgeno tamponado de Brucella, tanto la prueba con Rosa de Bengala (RB) como la prueba de aglutinacin buferada en placa (ABP), atribuyndosele a esta ltima una mayor especificidad (9).

Las reacciones positivas deben volverse a comprobar utilizando una estrategia confirmatoria adecuada. En Cuba se emplea la RB y la seroaglutinacin lenta en tubos (SAT) como tamiz, y como confirmatorias la prueba de 2-Mercaptoetanol (2-ME) y la reaccin de fijacin del complemento (RFC). El ensayo de RFC presenta la mejor correlacin con los aislamientos en animales, natural o experimentalmente infectados, lo que llev a su adopcin como mtodo de referencia para la validacin de otros ensayos serolgicos. Este trabajo tuvo como objetivo obtener y validar un antgeno buferado de Brucella abortus para la prueba de aglutinacin en placa (ABP) como prueba diagnstica de base de la brucelosis bovina.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utiliz la cepa 99 de B. abortus (Weybridge) (S99), la cual se conserva liofilizada en el cepario de la Empresa productora de Vacunas Virales y Bacterianas (EPVVB) de LABIOFAM, La Habana, Cuba y cumple con los requerimientos establecidos internacionalmente para este microorganismo. Para la produccin del antgeno, la cepa se multiplic en tubos de agar inclinado con medio de infusin de patata que se incubaron a 37C durante 48 h.

La pureza del crecimiento se comprob mediante la siembra en placas de Agar Patata (AP) y Agar Dextrosa Saboraud (ADS), y en tubos de Caldo Soya Triptona (CST), Caldo Tioglicolato (CT) y Caldo Andrade (CA) con campana de Durham, evalundose las caractersticas micromorfolgicas de las colonias en el medio slido y el grado de turbidez en medio lquido. El ensayo se consider satisfactorio, cuando se observaron colonias redondas, de 1-2 mm de dimetro, con bordes lisos, translcidas y de color miel plido en medio AP y produccin de turbidez ligera y homognea en CST, as como la no produccin de cido ni gas en CA. Tambin se realizaron pruebas de disociacin microbiana mediante el mtodo de inmersin en Cristal violeta (9).

La prueba se consider satisfactoria cuando se obtuvieron ms de un 90% de colonias bacterianas en fase lisa. Posteriormente el microorganismo fue cultivado en el medio lquido recomendado por la OIE (9) hasta llegar a escala de fermentador (400 L de volumen de cultivo) con un pH inicial de 6,6. Se utiliz un reactor tipo tanque agitado con sistema discontinuo (batch) y agitador tipo paleta. Durante el crecimiento se emple aireacin (1vvm) y agitacin (100 rpm) constantes. El proceso se control a partir de la medicin del pH (pHmetro HANNA) y la absorbancia (Espectrofotmetro Gnesis), as como la observacin microscpica del cultivo (microscopio ptico OLYMPUS) mediante tincin de Gram. Para confirmar su pureza se realizaron controles del proceso tanto en medio slido como lquido (antes mencionados). Tambin se determin la viabilidad por la tcnica de placa vertida (10).

Los valores de densidad ptica (DO) obtenidos se emplearon para confeccionar la curva de crecimiento del microorganismo en estas condiciones y la fermentacin se dio por concluida cuando dichos valores no tuvieron variacin significativa en el intervalo de una hora. Los microorganismos se inactivaron por calentamiento a 80C durante 90 min y se utiliz fenol como preservo al 0,5% (v/v). Despus de comprobar la total inactivacin del cultivo, la biomasa bacteriana se recobr mediante centrifugacin refrigerada de flujo continuo (centrifuga de flujo continuo, SHARPLES) a 17000 rpm y se resuspendi en tres partes de bfer de fosfatos fenolado al 0,5% (v/v). El volumen de clulas presentes en la suspensin inactivada se determin centrifugando por triplicado volmenes de 1 mL en tubos Wintrobe a 3000 rpm durante 75 min (centrfuga refrigerada de mesa, SIGMA).

Para la elaboracin de los lotes de ABP se aadieron 6 mL de colorante por litro de suspensin celular, y luego de agitar y filtrar la mezcla por algodn absorbente estril, se centrifug con 10000 rpm a 4C y las clulas teidas precipitadas se resuspendieron en diluyente tamponado (9) a una concentracin final de 14 g de clulas (en peso hmedo) por cada 100 mL de diluyente. De la suspensin madre coloreada se obtuvieron tres lotes de ABP que se envasaron en bulbos de vidrio incoloro de 10 mL con calidad hidroltica tipo II y boca de 20 mm y fueron sellados con tapn de bromobutilo gris de 20 mm y sello de aluminio anonizado de 20 mm. Luego de envasado el antgeno, se realizaron los controles de calidad correspondientes (determinacin de pH, volumen celular, esterilidad, capacidad buferante), considerndose como conformes los encontrados dentro los lmites que se muestran en la Tabla 1.

Las pruebas serolgicas se llevaron a cabo con una batera de sueros de bovinos procedentes de varias regiones de Cuba (Camagey, Pinar del Ro, Artemisa) previamente testados con las pruebas de diagnstico establecidas (RB, SAT y RFC), todas de produccin nacional (LABIOFAM). Dichos sueros se clasificaron de la manera que se muestra en la Tabla 2. Se emplearon un total de 1070 muestras de suero (350 positivas y 720 negativas) las cuales se procesaron con el ABP experimental y el ABP de referencia (SENASA, Argentina) simultneamente. Para la ejecucin del ensayo con ABP y la lectura e interpretacin de los resultados, se tom como referencia lo establecido por otros autores (9, 11) y se procedi de la siguiente manera: Se emple una placa de vidrio cuadriculada (limpia y seca) sobre el aglutinoscopio. Con micropipeta automtica apoyada sobre la placa de vidrio, se depositaron 80 L de cada muestra de suero, utilizando una punta para cada suero y 30 L de antgeno prximo a la gota del suero, con la precaucin de no tocar el suero para no contaminar con la punta el frasco de antgeno.

El suero y el antgeno se mezclaron bien con mezclador de acrlico, abarcando una superficie circular aproximada de 3 cm de dimetro. Se imprimieron 3 movimientos en forma rotativa a la placa de vidrio hasta homogeneizar la mezcla, se coloc la placa sobre el aglutinoscopio y se tap, permaneciendo la luz apagada. Se efectu una nueva rotacin, pasados 4 min y se dej en reposo otros cuatro. A los 8 min, rotando de nuevo la placa y con la luz encendida, se procedi a la lectura.

Lectura e interpretacin de resultados

Las reacciones se clasificaron en:

Positivas: Formacin de grumos, aun siendo finos.

Negativas: Cuando la mezcla suero-antgeno era de turbidez homognea y sin grumos.

El lmite de deteccin se determin preparando diluciones seriadas en base 2 (desde 1:2 hasta 1:1024) de una muestra positiva de referencia (Suero Patrn Nacional) que contena 1000 Unidades Internacionales de Fijacin de Complemento (UIFC), analizando cuatro replicados de cada dilucin. El proceso de evaluacin del desempeo se bas en la determinacin de una serie de parmetros a partir de tablas de contingencia 2x2 (11, 12) (Tabla 3).

Con respecto a la RFC se evaluaron los siguientes parmetros:

Sensibilidad diagnstica (S) S=a/(a + c) x 100

Especificidad diagnstica (E) E=d/(b + d) x 100

Valores predictivos positivos (VPP) y negativos (VPN) VPP = a/(a + b) x 100 VPN = d/(c + d) x 100

Eficacia = {(a + d) / (a + b + c + d)} x 100

Con respecto al ABP de referencia se evaluaron los siguientes parmetros:

Sensibilidad relativa (S) S=a/(a + c) x 100

Especificidad relativa (E) E=d/(b + d) x 100

Concordancia: mediante el clculo del ndice kappa (k) k = po pe / 1 pe

Donde: po = a + d / n y pe = (P + N) / n

Concordancia de los positivos P) = [{(a + b) / n} x {(a + c) / n}] x n

Concordancia de los negativos N) = (c + d) - {(a + c) P }

La concordancia de los resultados se estim segn la siguiente clasificacin (11, 12).

Concordancia Kappa
Deficiente <0,20
Deficiente 0,21-0,4
Moderada 0,41-0,6
Buena 0,61-0,8
Muy buena 0,81-1,00

 

RESULTADOS Y DISCUSIN

Los controles microbiolgicos realizados durante el escalado del proceso, desde la apertura de mpula en medio slido hasta el cultivo en fermentador, no mostraron evidencia de contaminacin microbiana. Se obtuvo un cultivo puro sin disociacin en formas rugosas. A partir de la centrifugacin del cultivo inactivado se logr el recobrado de la biomasa bacteriana con un peso hmedo de 645 g con la cual, luego de diluida en bfer de fosfatos, se obtuvo una suspensin estable de color blanco lechoso y consistencia densa (41% de concentracin celular determinada por el mtodo de Wintrobe), sin evidencia alguna de autoaglutinacin.

La prueba de inactividad realizada no mostr crecimiento alguno despus de 7 das de incubacin a 37C. Los resultados de los controles fsico-qumicos y microbiolgicos de los tres lotes experimentales de ABP elaborados se muestran en la Tabla 4. En los tres lotes experimentales as como en el ABP comercial, todas las caractersticas evaluadas resultaron estar dentro de los parmetros establecidos para este tipo de producto.

Como se ha establecido (9) la suspensin bacteriana de ABP debe tener un volumen de 10-12% de clulas teidas de coloracin azul verdosa. El pH del antgeno tamponado en placa debe ser de 3,70 0,03 y el pH de una mezcla suero-antgeno a una razn 8:3 debe ser de 4,02 0,04. El principio de esta prueba se basa en la inhibicininactivacin de algunas aglutininas inespecficas a pH bajo, fundamentalmente IgM. Es una prueba cualitativa muy sensible que detecta IgG1 y su positividad persiste por mucho tiempo.

En la Tabla 5 se muestra el desempeo analtico del ABP en estudio, observndose que el lmite de deteccin es de 1:128 (dilucin ms alta donde se observa una reaccin claramente positiva I). En las Tablas 6 y 7 se reflejan los resultados de la ejecucin del ensayo serolgico del ABP experimental con respecto a la prueba de RFC. En este ensayo se obtuvieron tres resultados falsos positivos con respecto a la prueba de RFC. Sin embargo, el desempeo diagnstico del antgeno fue muy bueno (Tabla 7).

Tal y como plantean varios autores (9, 13) esta prueba es muy sensible, especialmente para la deteccin de anticuerpos inducidos por otros agentes que comparten antgenos comunes y las muestras positivas deben volverse a verificar con pruebas confirmativas. Se ha reportado para esta prueba una sensibilidad del 99,5% y una especificidad del 95% (14). Otros autores (15, 16) reportaron valores de sensibilidad y especificidad del 99,9% y 97% respectivamente.

La prueba con ABP (al igual que la RB) puede dar reaccin positiva antes que las pruebas estndar de seroaglutinacin hayan alcanzado los ttulos correspondientes a clasificacin de reaccionante positivo, lo que se debe probablemente a niveles adecuados de IgG1 que reaccionan con el antgeno tamponado antes que la totalidad de anticuerpos (IgM e IgG2) logren ttulos o alcancen ser referenciales como diagnstico en otras pruebas convencionales (15). El diagnstico definitivo de cualquier enfermedad es obtenido por aislamiento e identificacin del agente, mtodo viable cuando se trabaja con rebaos. Pero en el caso de brucelosis, las operaciones de certificacin de rebaos libres se apoyan en el serodiagnstico, tenindose en cuenta en la eleccin de las pruebas a ser aplicadas, sus caractersticas intrnsecas, el costo y a la practicidad de la ejecucin. Existen varios ensayos utilizando antgeno acidificado buferado, como ABP y RB, y la mayora de los pases los usan dentro de una batera de tcnicas (16, 17).

El lipopolisacrido en fase lisa (LPS-S) de Brucella consta de una parte glicolipdica (lpido A), insertada en la membrana externa y otra polisacardica expuesta hacia el exterior. Esta ltima se divide en dos secciones: el ncleo o core, ms interno y la cadena O. Esta cadena es el antgeno inmunodominante de superficie, capaz de inducir una respuesta serolgica en la mayora de los animales en contacto con especies lisas de Brucella (B. abortus, B. melitensis y B. suis); adems es la estructura antignica ms expuesta y blanco de anticuerpos protectores. Sin embargo, la cadena O posee eptopes compartidos con otras especies bacterianas como Yersinia enterocoltica O:9, Vibrio cholerae, Salmonella landau, Escherichia coli O:157 H7, Pasteurella multocida, responsables de reactividad cruzada en las pruebas serolgicas que se basan en la deteccin de anticuerpos hacia este antgeno (18). De acuerdo con otros autores (19) no existe una nica prueba capaz de identificar todos los animales infectados o certificar todos los animales libres de la enfermedad.

Las reacciones positivas deben volverse a comprobar utilizando una estrategia confirmativa adecuada. La sensibilidad y especificidad diagnsticas son los principales indicadores de rendimiento del proceso de validacin. Las pruebas de anticuerpos se someten a los mismos procedimientos generales de estimacin de estos parmetros que los exigidos para otros tipos de pruebas. El nmero de animales necesario para estimar la sensibilidad y especificidad diagnsticas aceptables est en funcin del nivel de confianza deseado en dichas estimaciones y del error admisible que se acepte. En el caso de una enfermedad como la brucelosis, es necesario reducir la probabilidad de que los animales infectados se clasifiquen errneamente como no infectados, lo cual reduce el error admisible en el resultado de la prueba, lo cual, a su vez, aumenta el nmero de muestras necesarias para establecer un nivel alto de confianza en las estimaciones de la sensibilidad diagnstica (20).

En la Tabla 8 se reflejan los resultados de la ejecucin del ensayo serolgico del ABP experimental con respecto al ABP de referencia. En este caso hubo total coincidencia entre ambas pruebas al obtenerse la misma cantidad de muestras positivas y negativas en el panel de sueros empleado. El mtodo analtico candidato debe ejecutarse simultneamente a una prueba de referencia, empleando el mismo grupo de muestras en ambos, para determinar si el mtodo candidato muestra las mismas caractersticas cuantitativas y cualitativas que el mtodo estndar (20). El clculo de los parmetros que se utilizaron para la evaluacin del desempeo del ABP experimental con respecto al ABP comercial arrojaron una sensibilidad y especificidad relativas de un 100% y una concordancia igual a 1. Los resultados no mostraron diferencias en cuanto al desempeo de ambos antgenos. El ABP experimental mostr una sensibilidad y especificidad adecuadas y la concordancia result ser clasificada como muy buena. El uso de esta prueba, por un lado asociada a otros ensayos confirmatorios como 2-ME y RFC y por otro incluyendo el empleo de recursos humanos y econmicos, permitir ejecutar las campaas de control y erradicacin de la brucelosis en el pas con adecuada eficiencia.

 

REFERENCIAS

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Recibido: Julio de 2017              Aceptado: Agosto de 2017

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