Caracterizacin protemica de vesculas de membrana externa extradas de Shigella sonnei

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Caracterizacin protemica de vesculas de membrana externa extradas de Shigella sonnei

 

Proteomic characterisation of outer membrane vesicle extracted from Shigella sonnei

 

 

Mara de los A Padrn-Collaz1*, Ileana Martnez-Cabrera2, Wheeler J3, Sonia Nisar3, Luis A Rivern-Martnez1, Miguel E Martnez-Pozo1, Carmen R Soto-Rodrguez1, Olga M Martnez-Fernndez1, Ranset Diez-Martin1, Jos L Prez-Quioy1, Luis Garca-Imia1, Arturo Talavera-Coronel1, Gustavo V Sierra-Gonzlez1, Christopher Jones3

1 Instituto Finlay de Vacunas. Ave 27, No 19805, La Lisa, La Habana, Cuba.

2 Departamento de Biologa Fundamental y Ciencias de la Salud. Universidad de las Islas Baleares. Espaa.

3 Laboratory for Molecular Structure. National Institute for Biological Standards and Control, Blanche Lane, South Mimms, Herts EN6 3QG, UK.

 

email: mapadron@finlay.edu.cu

* Mster en Ciencias y Tecnlogo de II nivel.

 


RESUMEN

Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa (VMEs) previenen de manera exitosa la enfermedad meningocócica del serogrupo B. Esta plataforma tecnológica de obtención puede ser aplicada para otros patógenos bacterianos Gram negativos. Una vacuna de VMEs desarrollada contra Shigella sonnei fue obtenida a través de una extracción de componentes celulares y su caracterización por electroforesis en geles de poliacrilamida unidimensional (1D). Se estudiaron las mejores condiciones de solubilización de las muestras, separación electroforética e identificación a través de espectrometría de masas acoplada a cromatografía de alta presión después del corte de las bandas y su tratamiento enzimático con tripsina. En esta etapa se identificaron un total de 57 proteínas en 23 bandas (2,5 proteínas por banda escindida), 47 de las proteínas no repetidas. Las proteínas inmunogénicas presentes en VMEs de S. sonnei fueron cuantificadas en cuanto a masa molecular por 1D-Western blotting en membranas de nitrocelulosa con anticuerpos obtenidos a partir de ratones inmunizados con las VMEs. Como que las bandas electroforéticas 1D contenían más de una proteína, se estudiaron las mejores condiciones de separación por el método de electroforesis bidimensional (2D) para el establecimiento del mapa proteico; tal que el incremento del tamaño de las tiras, el tiempo de focalización y la aplicación catódica garantizaron la mayor resolución.

Palabras clave: Shigella sonnei, vacunas, métodos proteómicos, proteínas de membrana externa.


ABSTRACT

Outer membrane vesicles (OMVs) vaccines successfully prevent Group B meningococcal disease. This platform technology may be applied against other Gram negative bacterial pathogens. An OMV vaccine against Shigella sonnei was prepared by detergent extraction of cells and characterised by one-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (1D). The protein components were quantified by staining and scanning and the composition of bands were defined by coupled high-performance low chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry after band excision and in-gel trypsin digestion. 57 proteins contained in 23 bands (2.5 proteins/split band) were detected, 47 of them were not repeated. The S. sonnei OMVs immunogenic proteins were identified by 1D-immunoblotting, after transfer of proteins to a nitrocellulose membrane and treatment with antibodies generated by immunisation of mice with the OMVs. The bands detected by 1D had more than a single proteins, that is why we studied the best conditions for molecular separation by two-dimension electrophoresis (2D) for establishing the protein map; such that the increase of strips size, time of isoelectric focusing (IEF) and cup-cathodic loading guaranteed the highest resolution.

Keywords: Shigella sonnei, vaccines, proteomic, outer membrane proteins.


 

INTRODUCCIÓN

Las infecciones bacterianas continan siendo la causa de un gran nmero de nios fallecidos, especialmente en pases en desarrollo; de ah la necesidad de obtener vacunas efectivas, de bajo costo contra los principales patgenos. La shigellosis causada por Shigella sonnei, S. flexneri y S. dysenteriae es uno de los mayores problemas de la salud pblica en nios pequeos y jvenes en estos pases (1, 2).

En Amrica Latina, la resistencia de Shigella a los antibiticos se ha incrementado desde la dcada de los 90, principalmente contra S. sonnei (3). A pesar de que se han obtenido vacunas mltiples de diferentes serotipos de Shigella (a partir de su lipopolisacrido modificado) y que se han probado exitosamente en ensayos clnicos (4-6); no estn comercialmente disponibles. Algunas vacunas de subunidades de Shigella an estn en fase preclnica; incluyendo una vacuna parenteral compuesta por protena/ARN ribosomal (5) y una vacuna de proteosoma administrada por va nasal compuesta por micelas de protenas de membrana externa de Neisseria meningitidis serogrupo B unidas a lipopolisacridos (LPS) de Shigella (7). Un ensayo preclnico con una vacuna intranasal de Invaplex 50 S. flexneri 2a demostr que era segura, inmunognica y eficaz (8).

El Instituto Finlay de Vacunas ha sido de los primeros en desarrollar vacunas bacterianas compuestas por VMEs que contienen protenas de membrana externa (PMEs) extradas con detergentes a partir de las clulas, con el objetivo de proteger contra infecciones meningoccicas producidas por el serogrupo B ya que las vacunas de polisacrido B no son inmunognicas (9, 10). La separacin protemica de los componentes proteicos de las VMEs presentes en estas vacunas ha permitido que se pueda evaluar su complejidad en trminos de su identificacin y cuantificacin, lo cual ha permitido establecer el patrn proteico y preparar las condiciones para evaluar la consistencia del proceso de produccin (10-12).

Martnez y colaboradores (13) seleccionaron una cepa de S. sonnei (A-04) aislada de pacientes como el mejor candidato para explorar si la tecnologa de VMEs puede ser aplicada al desarrollo de una vacuna que proteja contra esta bacteria. Previamente se estudiaron 34 cepas aisladas a partir de heces fecales de pacientes con shigellosis que vivan en Ciudad de La Habana (entre los aos 1999 y 2000). Las pruebas realizadas en modelos animales (Test de Sereny e inoculacin nasal), nivel de expresin de protenas determinado a travs de electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) sugirieron que la virulencia era adecuada, los sntomas y el perfil de histopatolgico de la cepa A-04 eran adecuados para desarrollar una nueva vacuna (13). En un trabajo reciente realizado para demostrar el efecto de nueva vacuna compuesta por VMEs procedentes de S. flexneri, esta vacuna fue capaz de proteger contra la infeccin cuando se administr por va mucosal (14, 15).

En estos trabajos se identificaron ocho protenas: dos de estas protenas fueron previamente descritas como IpaD y OmpA. Las protenas identificadas como AnsB, TolC, Ggt, TolB se localizaron en la extraccin de protenas de membrana y en la fraccin de protenas solubles; mientras que GroEL, Spa33 e IpaD fueron detectadas exclusivamente como protenas solubles inmunognicas (15). Establecer estos patrones proteicos en nuestras preparaciones de VMEs permitir consolidar el sistema de control de calidad de nuevos candidatos para el desarrollo de vacunas. El objetivo de este trabajo es la extraccin de componentes proteicos de la membrana externa de la cepa de produccin A-04 de S. sonnei, con un detergente para la obtencin de VMEs, la identificacin de las protenas componentes a travs de mtodos protemicos y la caracterizacin de las protenas inmunoqumicas por Western blot.

 

MÉTODOS

Preparacin de las muestras en el Instituto Finlay

La cepa A04 de S. sonnei creció en un medio sintético optimizado de 20 L, a través de condiciones de fermentación discontinua tipo “batch”, a 37°C y con pH controlado a 7,4. Los cultivos se centrifugaron por espacio de 30 min, a 17700 x g, a 4°C. El sedimento lavado se resuspendió en tampón Tris 30 mM-EDTA 2 mM pH 8,5 hasta una concentración de 140 mg/mL. Las células se resuspendieron con una solución de duodecilsulfato de sodio (SDS) hasta una concentración final de 2 % w/v y se agitó suavemente en un baño de hielo, durante 1 h. Las suspensiones se centrifugaron a 17700 x g, a 4°C, durante 30 min.

Los sobrenadantes se trataron con una mezcla de DNAsa-RNAsa (0,1 mg/20 mL), a 37°C, durante 1 h y se centrifugó a 33300 x g, a 4°C, durante 15 min.

Los sobrenadantes se centrifugaron a 65000 x g, durante 8 h a 4°C y las PME sedimentadas se resuspendieron en Tris 30 mM EDTA 2 mM pH 8,5 y posteriormente se precipitaron con etanol (80 %) y se guardaron a –20°C.

Preparacin de la mezcla de sueros contra VMEs de S. sonnei en el Instituto Finlay

Los anticuerpos contra las VMEs de S. sonnei fueron obtenidos por inmunizacin intramuscular de la pata izquierda de ratones Balb/c (peso entre 20-25 g), con 50 g de protenas (determinado por el mtodo de Lowry) en tres dosis a tiempo: 0, 14 y 28 das. Los ratones se desangraron a los 14 das despus de la ltima inoculacin y se separ el suero por centrifugacin a 2300 g en una centrfuga modelo BBVV (JOAN LAB, Francia). Se unieron los sueros de 10 ratones y se conservaron a -20C para su uso en el mtodo de Western blotting.

Minielectroforesis y electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa a travs del mtodo de immunoblotting, realizado en el Instituto Finlay

Se aplicaron 20 g de protena en cada pocillo en un gel concentrador al 5% y un gel separador al 10%, con tampn de corrida (Tris-HCl 25 mM pH 8,3; glicina 192 mM; SDS 0,1%) en una cmara electrofortica (Pharmacia LKB, USA) acoplada a una fuente (Multidrive Pharmacia LKB, Suecia) y corriente constante de 30 mA. Las protenas separadas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa 0,45 m, utilizando un tampn Tris 0,02 M; glicina 0,15M; SDS 0,1%; pH 8,3 y un sistema de transferencia (Mini Blot, BioRad), a temperatura y corriente constantes (8C, 350 mA), durante 2 h. Las membranas se incubaron en tampn PBS-Tween con anticuerpos (dilucin 1/1000) presentes en una mezcla de sueros de ratones inmunizados previamente con VMEs extradas de S. sonnei y stos fueron detectados con antisuero anti-IgG conjugado a peroxidasa de rbano (Sigma). Las muestras se visualizaron con un sistema de desarrollo de color diaminobenzidineH2O2. Se evaluaron las VMEs extradas de S. sonnei obtenidas en este trabajo y las protenas de las clulas lisadas de Vibrio cholerae C7258; S. dysenteriae ATCC nmero 13313; S. flexneri (cepa 9), S. sonnei (cepa 1) a partir de preparados denominados STA (12).

Electroforesis en geles de poliacrilamida en una dimensin con un sistema macro electrofortico en el National Institute for Biological Standard and Control (NIBSC, Reino Unido)

La proteínas fueron solubilizadas en un tampón de lisis [Urea 7M; tiourea 2M; CHAPS 2% (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulphonate); Tritón X-100 0,5%; glicerol 15%; ditiotreitol (DTT) 1%; Pharmalyte 3-10 1% con inhibidor de proteasas], se calentaron a 100°C y se conservó a -20°C, hasta su uso. La concentración de proteína se determinó a través del kit de Bio-Rad (BioRad, Hemel Hempstead, UK). La electroforesis en geles (SDS-PAGE) se realizó en un sistema Electro Hoefer SE 600 acoplado a una fuente de corriente ECPS 3000/150 (40 mA) y un sistema termostato (Tempette TE-80), con una temperatura constante a 13°C. Las muestras fueron tratadas con un tampón para sistema Laemmli (Bio-Rad) e incubadas a 95°C, durante 5 min. Se aplicaron 30 µg en un gel 12% (1,5 mm x 12 cm x 15,5 cm) y finalmente se visualizó con un sistema de tinción de plata o sistema Coomassie.

Electroforesis en gel en segunda dimensin realizada en el NIBSC

La focalizacin isoelctrica (FI) se llev a cabo utilizando tiras de poliacrilamida e inmovilinas y un sistema IPGphor II System (Amersham, US). Las tiras de pH 3-11 NL (13 cm, 18 cm o 24 cm) se rehidrataron con tampn de lisis (como se describe anteriormente) conteniendo bromofenol azul (325, 450 o 600 L, respectivamente) y las muestras (de 40 o 100 g) se aplicaron de varias formas (directamente en tampn de lisis, con aplicacin andica con copa o con aplicacin catdica). La FI se realiz a 4C con 45, 60 o 100 KVh. Cada tira fue equilibrada en 10 mL de tampn 1 de equilibracin (Tris-HCl 50 mM pH 8,8; tiourea 2 M; urea 7 M; glicerol 30% v/v; SDS 2%, DTT 20 mg/mL: bromofenol azul), durante 10 min y en 10 mL de tampn 2 de equilibracin (Tris-HCl 50 mM pH 8,8, tiourea 2M, urea 7M, glicerol 30% v/v, SDS 2%, iodoacetamide 48 mg/mL, bromofenol azul), durante 5 min. La electroforesis bidimensional (12% SDS-PAGE) se realiz a 40 mA. Las condiciones utilizadas fueron: a) 13 cm, aplicacin en gel, 45 KVh; b) 13 cm, aplicacin andica en copa, 45 KVh; c) 18 cm, aplicacin catdica en copa, 45 KVh; d) 18 cm, aplicacin en gel, 45 KVh; 18 cm, aplicacin catdica en copa, 60 KVh; e) 18 cm, aplicacin en gel, 100 KVh. Los geles se revelaron con un sistema de tincin con plata y se escanearon en un densitmetro SI Scanner (Molecular Dynamics 375, Amersham Pharmacia).

Digestin del gel, anlisis por espectrometra de masas y bsqueda en bases de datos realizados en el NIBSC

Las bandas electroforticas de las VMEs de S. sonnei obtenidas por macroelectroforesis 1D y teidas con el sistema Coomassie fueron cortadas y digeridas con tripsina. Los fragmentos se separaron e identificaron por espectrometra de masas acoplada a cromatografa de alta presin (HPLC-EM), a travs de la secuenciacin peptdica y el anlisis de la informacin acerca del proteoma completo de S. sonnei contenido en las bases de datos proteicas Swiss-Prot y TrEMBL. Las secuencias de aminocidos generadas obtenidas y cotejadas en las bases de datos permitieron identificar el tipo de protena de Shigella sin necesidad de utilizar anticuerpos monoclonales especficos.

 

RESULTADOS

Preparacin de inmungenos de VMEs

Las vesculas de membrana externa (VMEs) se obtuvieron a partir de una cepa de S. sonnei (A-04) clnicamente aislada de un paciente; extradas con detergente SDS 2% a partir de su fermentacin a una escala de 20L. Estos preparados obtenidos se analizaron a travs de electroforesis 1D (SDS-PAGE) a escala analtica e immunoblotting, usando un suero inmune generado por inmunizacin con VMEs de esta preparacin (Fig. 1). Las protenas de las clulas lisadas (STA) a partir de otras cepas de V. cholerae C7258; S. dysenteriae ATCC nmero 13313; S. flexneri, cepa 9 y S. sonnei cepa 1, se evaluaron en paralelo con las VMEs de S. sonnei obtenidas en este trabajo. Se detectaron inmunoprotenas comunes a todas las especies con tamaos moleculares: 17,2; 22,1; 27,5; 38,7; 41,2; 43,8; 59,3; 66,8; 75-86 kDa. Algunas de estas bandas con tamaos moleculares cercanos al de las protenas referidas (38; 58; 65 kDa) por Martnez y col. (12), cuando analizaron la extraccin celular STA de esta cepa, durante la seleccin de las cepas candidatas para desarrollar una vacuna.

Separación de los componentes proteicos por electroforesis unidimensional (escala preparativa) y análisis por espectrometría de masas

En nuestro trabajo se utilizó un tampón de lisis y tratamiento de las proteínas de VMEs de mayor complejidad que el utilizado por Martínez y col. (12) en el estudio previo para el análisis de STA de células de S. sonnei cepa A-04, donde refirieron como proteínas mayoritarias las de tamaños: 35, 38, 58, 65 y 101 kDa.

Por otra parte, en nuestro tratamiento incluimos la incubación previa con el tampón de lisis a 100°C, durante 5 min, su congelación, posterior descongelación y finalmente el ajuste de la concentración e incubación con tampón Laemmli (Bio-Rad) nuevamente a 95°C (5 min). Adicionalmente en nuestro trabajo se modificó la concentración del gel separador a escala preparativa a 12% para favorecer la separación de proteínas con tamaños moleculares inferiores. Los resultados para el análisis de estas modificaciones utilizando la tinción con plata se muestran en las Figuras 2A y 2B. Las muestras calentadas a 100°C mostraron una menor abundancia en cuanto a proteínas con tamaños moleculares entre 34–38 kDa, probablemente porque se favorece la separación de proteínas hidrofóbicas.

Se detectaron además, dos bandas mayoritarias con 37 y 40 kDa y otras bandas múltiples de menor intensidad. Estas condiciones separan complejos de proteínas de altos tamaños moleculares con una baja movilidad y cadenas peptídicas de proteínas. La aplicación de cantidades de muestras de 20 a 40 µg en los geles de poliacrilamida y su tinción con Coomassie (Fig. 3) permitió una resolución aceptable para la posterior digestión de las bandas y su análisis por espectrometría de masas. Una parte del gel fue teñido con Coomassie y las bandas se cortaron manualmente (Fig. 3) para ser digeridas con tripsina y proceder a la identificación proteica por HPLC-EM. Los resultados de la secuenciación y comparación de los fragmentos con la información que brindan las bases de datos del proteoma de Shigella se resumen en la Tabla 1.

En muchos de los casos, las bandas simples contenían múltiples componentes proteicos, como se refirió previamente por Uli y col. para vacunas de VMEs meningocócicas (10). Se identificaron cuarenta y siete proteínas individuales no repetidas (57 en total), con algunas proteínas presentes en más de una banda (23 bandas), con una media de 2,5 proteínas por banda escindida.

Las bandas más intensas S12 y S13 contenían las proteínas de membrana: proteína de membrana externa A (OMP A), proteína de membrana externa porina C (PorC), proteína de membrana externa 1b (OMP 1b), la proteína hipotética Q3Z0B3, la proteína porina de membrana externa Q3Z1L6 entre otras; así como dos enzimas metabólicas de la glicolisis (gliceraldehído-3 fosfato deshidrogenasa A presente en citoplasma) y de la transferencia de fosfato en el metabolismo de fructosa y manosa (Mannose-1-phosphate guanyltransferase GDP). Las bandas S2, S3, S4 y S5 con menor intensidad contenían la proteína de membrana externa X (Tabla 1).

Electroforesis en gel bidimensional (2D) de los componentes de las vesculas de membrana externa

La electroforesis 2D requiere su optimizacin para la separacin de ciertas protenas hidrofbicas de membrana que tienden a agregarse en el paso de FI. Las condiciones iniciales de solubilizacin propuestas en este trabajo se basaron en las utilizadas de manera exitosa para el anlisis de la vacuna antimeningoccica de vesculas de membrana externa, segn como lo describieron Uli y col. (10). La conservacin de las muestras en el tampn de rehidratacin permiti evitar la prdida de resolucin debido a interacciones entre las PMEs y los lpidos de membrana sin ningn tipo de agregacin y precipitacin. En el presente trabajo se investigaron una serie de condiciones de aplicacin y corrida isoelctrica de las muestras en las tiras.

La Figura 4 muestra los mejores resultados obtenidos con las tiras de FI de pH 3 a 11, con 13 cm de longitud y un tiempo de FI de 45 kVh, aplicando la muestra en el gel (Fig. 4A); adems, una segunda variante en la que se reduce la precipitacin de las protenas bsicas en tiras de mayor dimensin (18 cm), con un incremento del tiempo de FI hasta 60 kVh y utilizando la aplicacin catdica con copa, permitieron la ptima separacin de las protenas de membrana en las condiciones investigadas (Fig. 4B). Los productos innovadores (primero en su clase) tienen un alto costo y riesgo de fracaso, pero debido a que resuelven por primera vez una necesidad mdica no satisfecha su valor en el mercado suele ser alto.

De igual modo, cuenta con personal talentoso con conocimiento de los procesos asociados y de las buenas prácticas, que puede satisfacer las demandas del mercado y las necesidades de investigación. Estas fortalezas se respaldan por las oportunidades que facilitan el interés creciente de clientes foráneos por comercializar los productos del CIM como son: el apoyo de la dirección del país, el prestigio y compromiso de la ciencia en Cuba (de la que el CIM forma parte), el trabajo conjunto de la institución con otros componentes de la comunidad científica por cubrir necesidades médicas no satisfechas con productos biológicos de calidad, en una concertación estratégica directa con el Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos (CECMED).

 

DISCUSIN

Muchos de los trabajos inmunoprotemicos publicados han identificado protenas inmunorreactivas, las cuales inducen respuesta de anticuerpos cuando las clulas enteras (S. flexneri y S. dysenteriae) se utilizan como inmungenos en ratones y en conejos. Jenninson y col. (15) detectaron diferentes protenas en estudios protemicos; cinco protenas en la fase de extraccin de protenas de membrana externa: OmpA, AnsB, TolC, Ggt y TolB; las protenas OmpA, TolC y AnsB se detectaron tambin como protenas solubles y otras tres protenas fueron identificadas como inmunognicas solubles frente a sueros de pacientes infestados con Shigella: GroEL, Spa33 y IpaD. La protena OmpA es probablemente una de las protenas de membrana externa inmunorreactivas mayoritarias, identificada como la protena de 35 kDa en los anlisis del inmunoproteoma (16-18). Este tipo de trabajo no es frecuente en S. sonnei.

En nuestro trabajo, esta protena se detect por secuenciacin de dos de las bandas electroforticas de 34,3 y 36,8 kDa; compartiendo movilidad electrofortica con la protena de membrana externa porina C (identificada por secuenciacin) y la protena de membrana externa 1b (identificada tambin por secuenciacin). Esta ltima tambin se present en bandas con 40,9 y 50,5 kDa. Detectamos la protena chaperonina 60 kDa por secuenciacin (conocida como GroEL con localizacin en el citoplasma) en las bandas electroforticas S20 y S21 de 73,5 y 76,2 kDa, respectivamente.

Como muestran los resultados, las protenas de membrana externa son mayoritarias; pero tambin estn presentes protenas caractersticas del citoplasma y que de alguna manera durante el proceso de extraccin de las vesculas, podran estar relacionadas con los lpidos de membrana o con el detergente de extraccin SDS o quedar atrapadas en el interior de la vescula. Estas bandas fueron reconocidas como inmunorreactivas por Western blotting con anticuerpos de ratn inducidos por las VMEs, lo que confirma la importancia de la presencia de las mismas en nuestras preparaciones. A la pregunta: Pudiera afirmarse absolutamente la identidad de una protena con electroforesis, sin el empleo de anticuerpos monoclonales?. S, es posible siempre que se utilice como parte del sistema de identificacin protemico. Esta herramienta no slo incluye mtodos electroforticos como procedimientos de separacin; tambin la aplicacin de HPLC a los fragmentos de las protenas presentes en las bandas previamente separadas por SDS-PAGE que son digeridas con la enzima tripsina por sitios especficos. En los fragmentos separados se identifican las secuencias por espectrometra de masas el cual es uno de los mtodos que sigue siendo de los ms exactos para estos fines.

La informacin obtenida se introduce en plataformas informatizadas en constante actualizacin que recogen todas las secuencias registradas acerca de los dominios proteicos caractersticos de especies. Aunque varios autores cuestionan la garanta de la exactitud en la identificacin, como Tsiatsiani y Heck (19) y otros afirman la necesidad de utilizar complementariamente mtodos inmunoqumicos para garantizar una adecuada cuantificacin (20); el hecho es que los avances en la protemica basada en la espectrometra de masas permiten estudios de expresin de isoformas, tasa de rotacin, localizacin subcelular, modificaciones postraduccionales e interacciones entre protenas (gracias al anlisis multidimensional del proteoma, integracin y visualizacin e intercambio de datos) (21), lo que hace que este sistema sea ms especfico que cuando se utilizan solo anticuerpos monoclonales.

En este trabajo, la combinacin de la extraccin con detergente SDS a partir de la etapa de fermentacin del microorganismo, la solubilizacin posterior de las VMEs con mezclas de detergentes y urea a altas temperaturas, su conservacin a bajas temperaturas, su posterior tratamiento con tampn de lisis para corrida electrofortica a altas temperaturas permiti una adecuada separacin e identificacin de los fragmentos proteicos. Estas protenas, estrechamente asociadas a lpidos, podran perderse si se utilizan tratamientos destinados a remover los fosfolpidos, como por ejemplo, con dietil ter. En nuestros resultados, la utilizacin de la solubilizacin y conservacin de las muestras de VMEs en el tampn de lisis propuesto evit los efectos de fondo de los lpidos en el gel teido.

En nuestros experimentos realizados en Western blotting la evaluacin de la reactividad inmunolgica cruzada se observ en muestras de lisados celulares de Shigella y Vibrio cholerae, reconociendo protenas tales como: protena de membrana externa X (S5), protena de membrana externa A, protena de membrana externa porina C, protena de membrana externa 1b, chaperonina 60 kDa, protena de membrana externa 3a, entre otras; que pudieran valorarse como candidatos vacunales contra shigellosis y clera. Como la muestra de VMEs de Shigella contiene protenas con una amplia gama de valores de puntos isoelctricos (pI), el aumento de la longitud de las tiras y el tiempo de focalizacin beneficiaron la resolucin de las protenas cidas y neutras; mientras que la resolucin de las protenas bsicas result ser mejor con la forma de aplicacin catdica y con el incremento de la cantidad de protena. Esta metodologa que proponemos, permitir el desarrollo de estudios futuros para establecer condiciones de crecimiento microbiano y criterios en el control de calidad de futuras vacunas. Las condiciones propuestas para la 2D sern tiles para la determinacin del perfil proteico inmunoqumico, que garantice el control de la calidad de una nueva vacuna que proteja contra S. sonnei.

Estos resultados constituyen un punto de partida en el Instituto Finlay de Vacunas para el desarrollo de estudios protemicos en VMEs de S. sonnei, aisladas a partir de cepas clnicas (pacientes) para su uso como vacuna. Aun hoy, estos resultados mantienen vigencia por cuanto se contina refiriendo la alta incidencia de shigellosis a nivel mundial, sin que se haya logrado una vacuna altamente protectora y barata, destinada a pases de Asia y Amrica Latina que continan sufriendo de esta enfermedad e incluso, contra otras enfermedades entricas. El mtodo propuesto para el aislamiento y purificacin a escala piloto de VMEs a partir de la cepa A04 aislada de pacientes infectados de S. sonnei, as como la metodologa protemica que proponemos, permitieron obtener un proteoma representado por las protenas de membrana externa ms importantes, descritas por su papel inmunognico como candidatas para su uso como vacunas. Muchas de estas protenas resultaron ser reconocidas inmunoqumicamente por anticuerpos inducidos por la inoculacin en ratones Balb/c de las propias VMEs, anticuerpos que reconocieron adems, protenas de otras cepas de S. dysenteriae, S. flexneri y V. cholerae.

 

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la Royal Society (Reino Unido) por la financiacin concedida en el ao 2007 para el desarrollo de la evaluacin de las muestras de VMEs de S. sonnei en el National Institute for Biological Standard and Control (Reino Unido), lo cual permiti que se llevara a cabo parte de este proyecto.

 

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Recibido: Julio de 2016              Aceptado: Octubre de 2017

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