Determinacin rpida de la identidad del polisacrido de Salmonella Typhi y toxoide diftrico en vacunas conjugadas

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Determinacin rpida de la identidad del polisacrido de Salmonella Typhi y toxoide diftrico en vacunas conjugadas

 

Rapid determination of the identity of Salmonella Typhi polysaccharide and diphtheria toxoid in conjugate vaccines

 

 

Dianelys Ochoa-Sicilia*, Jessy Pedroso-Fernndez, Elizabeth Gonzlez-Aznar, Dagmar Garca-Rivera, Osmir Cabrera-Blanco

Instituto Finlay de Vacunas. Ave 27, No. 19805, La Lisa. La Habana, Cuba.

 

email: dochoa@finlay.edu.cu

* Licenciada en bioqumica y biologa molecular. Departamento de Anlisis, Laboratorio Inmunoqumica. Especialista CITMA.

 


RESUMEN

El polisacrido Vi (PsVi) de Salmonella Typhi es un antgeno T-independiente y ha demostrado ser protector en adultos jvenes. Sin embargo, para aumentar la respuesta de anticuerpos y conferir propiedades T-dependientes al polisacrido, se ha conjugado a protenas. Dentro de los controles exigidos por los organismos regulatorios para estas vacunas est la identidad antignica de sus componentes y para eso se recomiendan el uso de tcnicas de Resonancia Magntica Nuclear o tcnicas serolgicas. El objetivo del presente trabajo, fue establecer las condiciones ptimas de trabajo de un Dot Blot que permitiera determinar, rpidamente, la identidad de los antgenos en vacunas conjugadas contra S. Typhi. Para ello, se estudiaron los tiempos de incubacin, las concentraciones ptimas de anticuerpo monoclonal (AcM) y del ingrediente farmacutico activo (IFA), as como los volmenes de aplicacin ptimos para las IFAs y formulaciones vacunales, tanto para el PsVi como para el toxoide diftrico (TD). Los resultados mostraron que para la determinacin de la identidad antignica fueron suficientes 5 L de muestras de los conjugados monovalentes en una dilucin de 1/10 (vol/vol) e igual volumen para las formulaciones vacunales. Qued demostrado que la concentracin de 2,5 g/mL para el AcM contra el PsVi y a 2 g/mL para el AcM contra TD fueron suficientes para la determinacin; mientras que los tiempos de incubacin fueron ajustados a 15 min con incubacin a 37 C. Como conclusin del trabajo se puede decir que quedaron establecidas las condiciones ptimas de trabajo para la determinacin rpida de la identidad antignica del PsVi y del TD presentes en IFA y formulaciones vacunales conjugadas.

Palabras clave: vacunas conjugadas, ensayo de identidad, Dot Blot, Salmonella Typhi.


ABSTRACT

Vi polysaccharide from Salmonella Typhi is a T-independent antigen that has proven to be protective in young adults. However, it has been conjugated to proteins in order to confer T-dependent properties to the polysaccharide, and improving the antibody response. The regulatory agencies require knowing the identity of antigens included in vaccines. The Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy and serological techniques are recommended. The aim of this work was to establish the optimal working conditions of a Dot Blot that would allow to determine quickly the identity of the antigens in conjugate vaccines against S. Typhi. The incubation times, optimum concentrations of monoclonal antibodies (MAb) and active pharmaceutical ingredient (API), as well as optimum application volumes for APIs and vaccine formulations were studied for both, PsVi and diphtheria toxoid (DT). It was proven that 5 L of samples of the monovalent conjugates were sufficient at a dilution of 1/10 (vol/vol) and an equal volume for the vaccine formulations. It was demonstrated that the concentration of 2.5 g/mL for the MAb against PsVi and 2 g/mL for the MAb against DT were suitable. The incubation times were adjusted to 15 min with incubation at 37 C. It was established a simple and rapid method for the specific identification of PsVi and DT present in API and conjugate vaccines.

Keywords: conjugate vaccines, identity assay, Dot blot, Salmonella Typhi.


 

INTRODUCCIÓN

Salmonella entrica, serovar Typhi es un Bacilo Gram negativo no encapsulado, causante de enfermedades sistmicas como la fiebre tifoidea o fiebre entrica, que puede llevar a la muerte si no es tratada debidamente, lo cual constituye un problema severo de salud pblica en casi todo el mundo (1).

Las vacunas empleadas para la inmunoprofilaxis de la fiebre tifoidea en la actualidad son: la vacuna atenuada de S. Typhi administrada oralmente y la de polisacrido purificado, que ha sido la ms usada y de la cual existen varias en el mercado (2-4).

Sin embargo, las vacunas polisacardicas, si bien son inmunognicas en individuos inmunocompetentes mayores de 2 aos de edad, la proteccin inducida por las mismas no es de larga duracin, ni se observa efecto de refuerzo. Por esta razn, la estrategia actual es conjugar los polisacridos a protenas, adquiriendo as estos T-dependencia y por tanto desarrollar una respuesta ms eficiente. De esta forma, estas vacunas inducen memoria inmunolgica, se incrementa la duracin e intensidad de la respuesta inmune, la avidez de los anticuerpos generados y se hacen inmunognicas incluso en nios pequeos (5, 6).

Los organismos regulatorios internacionales han establecido como uno de los requisitos para la produccin de vacunas conjugadas la identidad de los antgenos presentes en la formulacin. Esta evaluacin se realiza por Resonancia Magntica Nuclear (RMN) o mediante tcnicas inmunoqumicas, entre ellas los immunoblotting se destacan por su alta especificidad y sensibilidad, adems de su relativo bajo costo y fcil realizacin (7).

EL Dot Blot es una tcnica usada normalmente en estudios cualitativos, donde se utiliza como soporte slido el papel de nitrocelulosa. Las protenas son adsorbidas pasivamente en la membrana; se agregan sucesivamente anticuerpos especficos contra la protena de inters y conjugados anti-inmunoglobulinas ligados a una enzima. La adicin del sustrato especfico permite la visualizacin en el papel (8).

El presente trabajo tiene como objetivo la optimizacin de un ensayo de identidad para el polisacrido capsular de S. Typhi (PsVi) y de la protena portadora toxoide diftrico (TD) tanto en el ingrediente farmacutico activo (IFA) como en la formulacin final.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

IFAs y vacunas

Fueron evaluados varios lotes de IFAs (13.02; 13.03; 13.04; 13.05) que contenan el conjugado PsVi-TD y varios lotes de una formulacin vacunal (402; 405; 407; 408); todos obtenidos en el Instituto Finlay de Vacunas (La Habana, Cuba) en condiciones de buenas prcticas de produccin. Las IFAs fueron preparadas a una concentracin de 125 g/mL y las formulaciones vacunales se utilizaron sin dilucin previa.

Anticuerpos monoclonales

Se utilizaron AcM especficos anti-PsVi (4G3E11) y anti-TD (3G3F3) obtenidos en el laboratorio de anticuerpos monoclonales del Instituto Finlay de Vacunas.

Dot Blot

Las muestras se aplicaron manualmente en membrana de nitrocelulosa (MNC) de 0,45 m de tamao de poro (Bio-Rad, EUA) y se dej hasta que se secara. Se realizaron varios Dot Blot con los siguientes objetivos: determinar el volumen de aplicacin ptimos para las IFAs; determinar las concentraciones ptimas de los AcMs (anti-PsVi y anti-TD); Determinar el tiempo de incubacin y por ltimo, probar las condiciones establecidas en la identidad del PsC Vi en varios lotes de IFAs y vacunas (9).

Determinar el volumen de aplicacin ptimo para las IFAs

Para este estudio fueron inmovilizados en dos tiras de MNC 2, 5 y 10 L de la IFA 13.04, ajustada previamente a una concentracin de 125 g/mL; una de las tiras se incub con AcM anti-PsVi y la otra con el AcM anti-TD. La concentracin de los AcM empleados en este ensayo fue de 5 g/mL. El resto de la tcnica sigui el procedimiento ya descrito.

Determinar las concentraciones ptimas de los anticuerpos monoclonales

Como muestra antignica se utiliz el mismo lote de IFA empleada en los acpites anteriores (13.04). Se aplicaron en 6 tiras, volmenes de 2,5 y 10 L de la IFA a 125 g/mL. El paso del bloqueo se realiz con leche descremada (LD) al 3% en Solucin Salina Tamponada con Fosfatos 0,15M, pH 7,2 (SSTF), mientras que la incubacin y lavados se realizaron igual a lo descrito en el acpite anterior. Las tiras fueron divididas en dos grupos de tres tiras (una tira para cada una de las concentraciones de los AcM estudiados). Se utilizaron tres concentraciones diferentes para cada AcM (2,5; 5 y 10 g/mL para el AcM anti-PsVi y 2, 5 y 10 g/mL para el AcM anti-TD todos en LD al 1% en SSTF). El resto de la tcnica se realiz segn lo descrito en el acpite anterior.

Determinacin del tiempo de incubacin ptimo

Fueron aplicados en cuatro tiras de MNC 2,5 y 10 L de la IFA 13.04, ajustada previamente a una concentracin de 125 g/mL. Dos tiras se utilizaron para el estudio con el AcM anti-PsVi y las otras dos con el AcM anti-TD. Posteriormente se procedi al proceso de bloqueo de los sitios activos remanentes con LD al 3% en SSTF durante 30 o 15 min a 37C. Despus de tres lavados de 5 min cada uno con SSTF/Tween 20 al 0,05%, fueron incubadas con el AcM correspondiente en cada caso (2,5 y 2 g/mL para el AcM anti-PsVi y anti-TD respectivamente, ambos diluidos en LD al 1% en SSTF, durante 30 o 15 min a 37 C. Seguidamente las membranas fueron lavadas en la solucin de lavado de la misma forma antes descrita. Posterior a los lavados, las MNC fueron incubadas a 37 C con anti IgG de ratn conjugado a peroxidasa (Sigma, USA), a una dilucin de 1:5000 en LD al 1% en SSTF, durante 30 o 15 min. Posteriormente se realizaron 3 lavados de 5 min y se procedi al revelado, para lo cual se cubri cada tira con SSTF/3,3-tetrahidrocloro diaminobenzidina (DAB) al 0,04% y perxido de hidrgeno (H2O2) al 0,5%, durante 10 min. La reaccin se detuvo realizando varios cambios con agua destilada.

Prueba de identidad del polisacrido Vi de S. Typhi y del toxoide Diftrico en lotes de IFAs y vacunas

Una vez que contamos con todos los parmetros de la tcnica ajustados, escogimos cuatro lotes de IFAs (13.02; 13.03; 13.04; 13.05) que contenan el conjugado PsVi-TD y varios lotes de una formulacin vacunal con la misma composicin (402; 405; 407; 408). Se aplicaron 5 L de las IFAs, ajustadas a una concentracin de 125 g/mL y 5 L de las formulaciones vacunales directamente del bulbo. Una tira se evalu contra el AcM anti-PsVi y la otra con el AcM anti-TD. El resto de la tcnica se realiz aplicando los resultados obtenidos en los acpites anteriores.

Digitalizacin de las imgenes

Las imgenes de los Dot Blot fueron digitalizadas utilizando un densitmetro GS-800 (Bio-Rad, EUA) con software de captura (Quantity One, Bio-Rad, EUA).

 

RESULTADOS Y DISCUSIN

La necesidad de conjugar el PsVi para mejorar su respuesta inmune, hizo necesario establecer tcnicas analticas para determinar su identidad. Debido a las bajas concentraciones a las que estos antgenos se encuentran en las formulaciones vacunales, las tcnicas ms empleadas han sido las de RMN, que determina su estructura pero que puede resultar complejo y caro, y las inmunoenzimticas donde se emplean AcM especficos; estn ltimas son ms sencillas pero pueden ser un poco extensas (9-12).

Determinacin del volumen de aplicacin ptimo para las IFAs

Como se puede observar (Fig. 1), para los tres volmenes de aplicacin de la IFA 13.02, se aprecia una mancha de igual intensidad y proporcional al volumen aplicado para los dos antgenos en estudio. Teniendo en cuenta que los volmenes evaluados son muy pequeos y que estos corresponden a cantidades de hasta 0,25 g de antgenos, es posible realizar el ensayo con mucha menos cantidad de muestra (9-12), lo cual constituye una ventaja para el laboratorio. No fueron estudiados volmenes mayores ya que al aplicar la muestra en la MNC de forma manual, esta difunde en la membrana y pueden llegar a unirse, lo que pudiera producir falsos positivos. De los tres volmenes evaluados se escogi 5 L como volumen ptimo, porque para aplicar 10 L se necesita un tiempo adicional en el secado despus de su aplicacin y por ser 2 L un volumen tan pequeo que pudiera introducir errores.

Determinacin de las concentraciones ptimas de los anticuerpos monoclonales

Teniendo como referencias otros estudios de concentracin ptima del AcM anti PsVi (11) se decidi evaluar 2,5 g/mL como concentracin mnima, por otro lado del AcM anti TD no se conocan reportes por lo cual teniendo en cuenta resultados preliminares en el laboratorio se decidi evaluar 2 g/mL como concentracin mnima. Los resultados obtenidos de este estudio son mostrados en la Figura 2. En cada caso, las tres concentraciones de AcM estudiadas dieron resultados positivos, incluso sin mucha diferencia en la intensidad del color entre las tres concentraciones evaluadas y para cada antgeno, por lo cual podemos afirmar que 2 g/mL para el AcM anti-TD y 2,5 g/mL para el AcM anti-PsVi son suficientes para realizar el ensayo. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Gonzlez-Aznar E. y cols. (10) quienes obtuvieron resultados similares al evaluar este AcM, con la diferencia que en su trabajo emplearon condiciones de incubacin de 1h a 37 C para el AcM y para el conjugado anti-IgG utilizado, mientras los resultados mostrados en la Figura 2 fueron obtenidos con 30 min a 37 C para todas las incubaciones, excepto para el revelado. De esta forma optimizamos la tcnica, ya que se obtienen resultados similares con menor cantidad de antgenos y tiempo. La concentracin, tanto de la muestra (conjugado Vi-TD) como del AcM es un factor importante a tener en cuenta, pues esta determina la formacin del complejo Ag-Ac, es decir, en tanto aumente la formacin del complejo, mayor ser el reconocimiento por parte del conjugado anti IgG-peroxidasa y por tanto mayor ser la intensidad del color de la mancha obtenida (11). Otras razones son, el costo de los AcM, la complejidad de su obtencin y su utilidad como herramienta para los ensayos analticos, es importante entonces que se utilice la concentracin mnima a la cual funcione el ensayo.

Estudio del tiempo de incubacin

El tiempo de incubacin es un parmetro a tener en cuenta para la optimizacin de la tcnica ya que este constituye una de las desventajas de las tcnicas inmunoenzimticas al hacerla ms engorrosa. Para ambos tiempos estudiados se observaron manchas oscuras con intensidad similar, representativas de una respuesta positiva a la presencia en las muestra de los antgenos estudiados; por tanto, se puede realizar con tiempos de incubacin de 15 min sin que por esto se vea afectado el resultado (Fig. 3). Este resultado constituye una ventaja ya que no se tienen reportes de tiempos de incubacin tan cortos para tcnicas de este tipo, de esta forma se elimina una de las principales desventajas del mtodo.

Prueba de identidad del PsVi y del TD en lotes de IFAs y vacunas

Como ensayo final se prob la funcionalidad de las condiciones establecidas en la identidad de varios lotes de IFAs y formulaciones vacunales (Fig. 4). Como se puede observar todas las muestras dieron resultados positivos, lo cual permiti asegurar que con las condiciones establecidas en este trabajo se puede determinar la identidad antignica en IFAs y formulaciones vacunales, quedando establecido un mtodo para determinar la identidad de las mismas.

 

REFERENCIAS

1. Hart PJ, OShaughnessy CM, Siggins MK, Bobat S, Kingsley RA, Goulding DA, et al. Differential Killing of Salmonella enteric Serovar Typhi by Antibodies Targeting Vi and Lipopolysaccharide O:9 Antigen. Plos One. 2016;11(1). Disponible en: http://researchonline.lshtm.ac.uk/2534165/1/pone.0145945.pdf.

2. Cabrera O, Cuello M, Soto SR, Pérez O, Taboada CM, Fariñas M, et al. Preparación y evaluación de conjugados de polisacárido Vi de Salmonella Typhi con toxoide tetánico. VacciMonitor 2002;11(2):6-9.

3. NCBI Vaccines for preventing typhoid fever [database on the internet]. Bethesda: NCBI; c2000. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10796623.

4. Keddy KH, Klugman KP, Hansford CF, Blondeau C, Bouveret-Le CN. Persistence of antibodies to the Salmonella Typhi Vi capsular polysaccharide vaccine in South African school children ten years after immunization. Vaccine 1999;17:110-3.

5. Lindberg AA. Glicoprotein conjugate vaccine. Vaccine 1999;17:28-36.

6. Chinnasami B, Mangayarkarasi V, Prema A, Sadasivam K, Davis MJ. Safety and Immunogenicity of Salmonella Typhi Vi conjugate vaccine (PedaTyphTM) in children up to five years. International Journal of Scientific and Research Publications 2013;3(2):1-5.

7. World Health Organization. WHO Expert Committee on Biological Standardization, 60th report. Geneva: WHO; 2013.

8. Lomonte, B. Manual de Métodos Inmunológicos. San José: Universidad de Costa Rica; 2007.

9. Cabrera O, Pisonero M, Rodríguez M, Pérez R, González E, Pedroso J, et al. Dot blot para identidad del polisacárido de Streptococcus pneumoniae serotipo 14 y toxoide tetánico en vacunas conjugadas. Revista Cumbres 2016;2(2):31-7.

10. González-Aznar E, Otero-Alfaro O, Amín-Blanco N, Reyes-López F, Cuello-Pérez M, Ramírez-Bencomo F. Producción, purificación y caracterización del AcM contra polisacárido capsular Vi de Salmonella Typhi y su aplicabilidad en ensayos de identidad. Revista Bioprocesos 2015;1(3):1-12.

11. González-Aznar E, Otero-Alfaro O, Cabrera-Blanco O, Ramírez-Bencomo F, Fajardo-Sánchez A, Mandariote-Llanes A, Cuello-Pérez M. Evaluación de los Anticuerpos Monoclonales anti-polisacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupos A, C, Y, W y X para su uso en los ensayos de identidad. VacciMonitor 2015;24(2):64-70.

12. Cabrera-Blanco O, Pisonero-Triana M, Rodríguez-Bejerano M, Pérez-Nicado R, González-Aznar E, Rodríguez-Noda LM, et. al, Dot Blot para determinar la identidad antigénica en vacunas conjugadas contra Streptococcus pneumoniae serotipo 19F. VacciMonitor 2017;26(1):1-7.

 

Recibido: Noviembre de 2016              Aceptado: Enero de 2017

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