Determinacin de la eficacia de los desinfectantes empleados en las reas aspticas de un centro productor de biofarmacuticos

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Determinacin de la eficacia de los desinfectantes empleados en las reas aspticas de un centro productor de biofarmacuticos

 

Determination of the efficacy of the disinfectants employed in the aseptic areas at a biopharmaceuticals production center

 

 

Eidelys Daz-Enriquez1*, Orestes Mayo-Abad2, Ichell Mir-Frutos1, Yanel Prez-Gutirrez1, Anna Tsoraeva1

1 Centro Nacional de Biopreparados, Mayabeque, Cuba.

2 Facultad de Ingeniera Qumica, Universidad Tecnolgica de La Habana Jos Antonio Echeverra, Habana, Cuba.

 

email: omayo@infomed.sld.cu

* Mster, Centro Nacional de Biopreparados, Departamento de Control de Procesos.

 


RESUMEN

En la industria biofarmacéutica, la desinfección se ha hecho parte fundamental de las actividades para controlar el nivel de microorganismos contaminantes que puedan llegar a comprometer la calidad del producto final. El objetivo de este trabajo fue evaluar la eficacia de los desinfectantes AniosSpecial DJP SF, Aniosurf Premium, Bacteranios SF, Aniospray 29, Aseptanios AD y Surfanios utilizados en la limpieza y desinfección del área aséptica de la Planta de Productos Parenterales 2 del Centro Nacional de Biopreparados (Mayabeque, Cuba). Se comprobó la eficacia con pruebas de desafío en superficies y en condiciones prácticas de uso. Se comparó estadísticamente el número de microorganismos aislados y la microbiota presente en el área antes y después del uso de los desinfectantes. Todos los desinfectantes cumplieron con los requisitos establecidos. Por lo tanto, se demostró su eficacia para realizar la limpieza de las áreas asépticas.

Palabras clave: desinfectantes, contaminacin, reas aspticas, industria biofarmacutica.


ABSTRACT

In the biopharmaceutical industry, disinfection has become a fundamental part of the activities to control the level of contaminants microorganisms that could compromise the quality of the final product. The objective of this work was to evaluate the efficacy of the disinfectants Anios Special DJP SF, Aniosurf Premium, Bacteranios SF, Aniospray 29, Aseptanios AD and Surfanios for the cleaning and disinfection of the aseptic area at the Parenterals Products Plant 2 (PPP2) at the National Center for Bioproducts (Mayabeque, Cuba). The efficacy was checked with challenge tests in surfaces, in practical usage conditions. The number of isolated microorganisms and the microbiota present before and after use was compared statistically. All the disinfectants complied with the established requirements. Therefore, the efficacy of the disinfectants was demonstrated to perform the cleaning and disinfection of the aseptic areas.

Keywords: disinfectants, contamination, clean rooms, biopharmaceutical industry.


 

INTRODUCCIÓN

El Centro Nacional de Biopreparados (BioCen) de Mayabeque, Cuba, se dedica a la produccin de biofarmacuticos en sus plantas, contando con reas aspticas destinadas a la formulacin y llenado de parenterales de bajo volumen bajo procesamiento asptico. Uno de los principales problemas a los cuales la industria farmacutica se enfrenta en la actualidad, es demostrar el cumplimiento de los estndares ambientales en sus reas de trabajo, principalmente en las consideradas como reas aspticas.

La existencia de stas, permite trabajar en condiciones higinicas ptimas en las que el nmero de agentes microbianos se vean reducidos al mnimo. Por este motivo, es crtico que cualquier empresa farmacutica siga las normas de las Buenas Prcticas de Fabricacin (BPF) regidos fundamentalmente por las Normas ISO (1), y por diferentes guas regulatorias establecidas por el Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Mdicos (CECMED), la Administracin de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA por sus siglas en ingls), la Farmacopea de los Estados Unidos (en ingls United States Pharmacopeia, (USP)) y la Organizacin Mundial de la Salud (OMS)(2-4). Para mantener los niveles higinicos de las reas de produccin es importante la eleccin de los agentes desinfectantes, as como los mtodos de aplicacin de los mismos. Las agencias regulatorias exigen frente al control de la contaminacin implementar mtodos vlidos para evaluar la eficacia de los desinfectantes usados en las reas (5, 6). La eficacia de un desinfectante depende de su concentracin, el tiempo de contacto, la naturaleza de la superficie desinfectada, la cantidad de material orgnico presente en la superficie, y el tipo y la cantidad de microorganismos presentes (7).

El tiempo de contacto es un factor fundamental para asegurar la desinfeccin. Usualmente el tiempo elegido son cinco minutos, ya que representa el tiempo en el que muchos desinfectantes permanecen en las superficies que no estn en posicin horizontal (8). Esto significa que los desinfectantes deben ser capaces de asegurar un efecto biocida en cinco minutos o menos, de acuerdo al tipo de aplicacin. Sin embargo, algunos biocidas pueden adherirse a la superficie aumentando el tiempo de contacto (9). Los microorganismos en funcin de su estructura celular, composicin y fisiologa, varan en su respuesta a los desinfectantes. La mayor resistencia la presentan las esporas bacterianas, seguidas de las micobacterias, quistes de parsitos, pequeos virus no encapsulados, bacterias Gram negativas, bacterias Gram positivas y, por ltimo, los virus con cpsula lipdica. Los mohos generalmente son ms resistentes que las levaduras y mucho ms resistentes que las bacterias no esporuladas, pero ms sensibles que las bacterias esporuladas. Las partculas biolgicamente activas pueden ser virus, bacterias, levaduras, mohos o esporas que interactan con el ambiente circundante para propsitos especficos. Tales partculas biolgicas sedimentan, crecen y ocasionalmente forman una masa de clulas llamada biopelcula, que define atoda la microbiota contaminante y patgena que se forma en grupos celulares, espacialmente organizados y encerrados en una matriz de polmeros orgnicos, sobre la superficie de los alimentos o las superficies en contacto con ellos.

La presencia de estas biopelculas en las superficies afecta a la eficacia de los agentes antimicrobianos, bien sea por interaccin con la matriz (clulas y polmeros), o por la escasa difusin de los antimicrobianos a travs de ella (10). El nmero de microorganismos afecta la accin del desinfectante, debido a que una mayor carga microbiana requiere mayores concentraciones de desinfectante o tiempos de contacto ms prolongados y puesto que no siempre se consigue una adecuada desinfeccin de la superficie con estos incrementos, se hace necesaria una combinacin de factores (10). El diseo de los equipos, la seleccin de los materiales y el tratamiento que se realice sobre ellos para limitar la adherencia de los microorganismos despus de la limpieza y desinfeccin, son factores determinantes en la higiene de las superficies. Materiales extremadamente porosos o rugosos ofrecen una superficie ms apropiada para la adherencia, la presencia de estas irregularidades favorece el refugio de residuos orgnicos y microorganismos. De igual manera, las grietas, ranuras y manchas de corrosin dificultan los procesos de limpieza y desinfeccin. Las paredes, los techos y los suelos deben ser lisos, impermeables a los lquidos y resistentes a los productos qumicos y desinfectantes. El material ms prctico y por consiguiente el ms utilizado en los equipos y superficies de trabajo es el acero inoxidable, ya que puede tratarse previamente de diversas maneras con el fin de obtener superficies fciles de limpiar, adems de ser un material estable (11). Es objetivo de este trabajo evaluar la eficacia de los desinfectantes AniosSpecial DJP SF, Aniosurf Premium, Bacteranios SF, Aniospray 29, Aseptanios AD y Surfanios, para la limpieza del rea asptica de la Planta de Productos Parenterales 2 (PPP2) de BioCen.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Valoracin de la eficacia de los desinfectantes in situ

Desinfectantes de superficies: Para los ensayos de eficacia se emplearon los productos de desinfeccin de superficies (Aniosurf Premium, Bacteranios SF y Surfanios) que cumplen con las caractersticas de ser detergentes desinfectantes para suelos y superficies; se utilizaron a una concentracin de 0,25%.

Desinfectantes de superficies por va area: Los productos de desinfeccin de superficies por va area (Anios Special DJP SF, Aniospray 29 y Aseptanios AD) cumplen con las caractersticas de ser detergentes desinfectantes para suelos y superficies que se utilizan de forma pura. La eficacia de los desinfectantes se cuantific, mediante prueba de reto en superficie, frente a las cepas que exigen las regulaciones y las seleccionadas como flora autctona del rea asptica de la PPP2 de BioCen. Para ello se utilizaron segmentos de superficies como acero, panel, piso y cristal de acuerdo a lo recomendado por la Asociacin Espaola de Normalizacin y Certificacin (12-14). Las cepas de referencia, as como cepas aisladas de la microbiota autctona del rea asptica de PPP2 fueron suministradas por el Cepario de BioCen y se muestran a continuacin:

• Cepas de referencia

Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231 y Aspergillus brasiliensis ATCC 16404.

• Cepas autóctonas

Micrococcus sedentarius y Staphylococcus hominis.

Diseo del ensayo

Para Segn lo regulado en la USP 37(5) las superficies a ensayar se marcaron con cuadrantes de 25 cm2, dos de los cuales correspondan al control positivo y los otros al desinfectante, tal como se muestra en la Figura 1.

Se realizaron dos diluciones seriadas a partir del medio de conservacin de cada cepa en tubos de 9 mL de solucin salina fisiolgica (SSF) hasta la dilucin donde se esperaba obtener una concentracin de 104 UFC/0,1 mL. Se sembr por duplicado en placas de Agar Triptona Soya (ATS), 0,1 mL de la dilucin correspondiente. Posteriormente se inocul en cada cuadrante de la superficie 0,1 mL del microorganismo a ensayar, y se dej secar el inculo en la superficie a temperatura ambiente.

La biocarga de los cuadrantes correspondientes al control positivo fue recolectada mediante hisopado de superficie. El hisopo se utiliz inclinndolo en un ngulo de 30. El hisopo con la biomasa recogida se coloc en un tubo con 10 mL de SSF. De este, se tom 1 mL y se transfiri a un tubo con 9 mL de SSF (dilucin 1/10). A partir de ambos tubos, se sembraron por duplicado placas de ATS, a razn de 0,1 mL de suspensin por placa. Se aplic el desinfectante a ensayar en los cuadrantes correspondientes a la muestra y se dej en contacto con el microorganismo durante 10 min. Pasado el tiempo de contacto se simul el proceso de limpieza. Luego, empleando un equipo de filtracin por membrana, se filtr a travs de una membrana de nitrato de celulosa de 0,45 m el contenido de los tubos de 10 mL correspondientes a la recogida de biocarga de los cuadrantes de muestra. Por ltimo, se colocaron las membranas en placas de ATS con neutralizantes (lecitina al 0,07%, polisorbato 80 al 0,5%; histidina al 0,05% y tiosulfato de sodio al 0,05%) y se incubaron las placas inoculadas con bacterias vegetativas a 372,5 C durante 20 a 24 h y las inoculadas con bacterias esporuladas y hongos de 31 2,5 C durante 24 a 72 h. Con los datos obtenidos se emple la frmula siguiente:

Eficacia del desinfectante= Log UFC/10mL(Control positivo) Log UFC/10mL(muestra)

El desinfectante es eficaz si el mismo logra reducir la carga microbiana al menos en dos rdenes logartmicos, para los que tienen accin contra las esporas bacterianas y hongos y al menos tres rdenes logartmicos para los que tienen accin contra bacterias vegetativas.

Comparacin del nmero de microorganismos antes y despus del uso de los desinfectantes

El estudio fue realizado en el rea de preparacin de materiales de la PPP 2, clasificada como grado D, el lmite de aceptacin en Grado D para el muestreo de superficies por placas de contacto RODAC es de 50 ufc/ 25 cm2. Se comprob la efectividad del esquema de rotacin de los desinfectantes propuestos en la Tabla 1 para un mes de trabajo (enero 2016). Los muestreos fueron realizados a las 7:00 a.m. (rea limpia) y posteriormente a las 3:00 p.m. (rea sucia) de todos los das del mes para un total de 27 muestras antes de limpiar y 27 muestras despus de la limpieza por cada superficie, para un total de 162 muestras. Las muestras fueron tomadas durante los muestreos rutinarios a las reas, siguiendo los procedimientos establecidos en el centro para el muestreo de superficies. Las placas utilizadas en los muestreos fueron incubadas de 30-35 C durante 48 h para bacterias y a 20-25 C por 72 h para hongos.

Tratamiento estadstico de los resultados

Los resultados obtenidos en los muestreos de las superficies antes y despus de la limpieza del local fueron procesados mediante pruebas de hiptesis para la comparacin de medianas con la prueba no paramtrica de Wilcoxon. Tambin se utiliz la prueba de Mood para evaluar la hiptesis de medianas iguales. Todas las pruebas se realizaron para un 95% de confianza (a=0,05).

Comparacin de la microbiota del rea antes y despus del empleo de los desinfectantes

Se caracteriz la microbiota endgena del rea segn los procedimientos establecidos en BioCen, antes y despus de la limpieza con los nuevos desinfectantes. Se compararon los microorganismos obtenidos, para determinar si hay variacin de dicha microbiota.

 

RESULTADOS Y DISCUSIN

Anlisis in situ de la actividad bactericida de los desinfectantes

En la Tabla 2 se muestran los resultados obtenidos con los desinfectantes Surfanios, Bacteranios SF y Aniosurf Premium respecto a la actividad bactericida. Como se puede observar los desinfectantes se declaran eficaces contra bacterias vegetativas, pues logran reducir la carga microbiana en 3 o ms logaritmos, de acuerdo a los requerimientos establecidos por Guerra (15). Con todos los desinfectantes se obtuvieron resultados similares a los reportados por Daz-Enriquez en 2016 (16).

Hernndez (17) obtuvo resultados similares al retar los desinfectantes Solprogel, Perasafe y Cidex con las mismas cepas evaluadas en este trabajo. Tambin Gallardo (18) realiza la evaluacin de la accin antimicrobiana de un desinfectante de uso industrial y domstico sobre cepas de Staphylococcus aureus y Escherichia coli, obteniendo resultados satisfactorios. En los trabajos mencionados anteriormente el criterio de reduccin usado fue de ms de 3 rdenes logartmicos para bacterias vegetativas.

Anlisis in situ de la actividad fungicida de los desinfectantes

En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos respecto a la actividad fungicida. Como se puede observar los desinfectantes se declaran eficaces contra hongos, pues disminuyen la carga microbiana en ms de dos rdenes logartmicos de acuerdo a los requerimientos establecidos por Guerra (15). Los resultados de eficacia fungicida son similares a los logrados por Daz-Enriquez (16).

Resultados de la comparacin del nmero de microorganismos antes y despus del uso de los desinfectantes

La Prueba de Wilcoxon para la comparacin de las medianas del nmero de microorganismos detectados antes y despus del uso de los desinfectantes, monitoreados durante un mes de trabajo, indicaron diferencias estadsticamente significativas, con valores p de 0,004; 0,008 y 0,007 para el techo, pared y piso respectivamente. Las pruebas de Mood tambin indicaron diferencias estadsticamente significativas con valores p de 0,035; 0,007 y 0,003. En todos los casos se rechaza la hiptesis de que no existen diferencias estadsticamente significativas para a = 0,05 (19).

Resultados de la comparacin de la microbiota del rea antes y despus del empleo de los desinfectantes

Con esta comparacin se pudo apreciar que la microbiota endgena del rea asptica de PPP2 no sufri cambios significativos con el uso en la limpieza de los nuevos desinfectantes (Fig. 2). En ambos casos, antes y despus del uso, prevaleci el gnero Staphylococcus sp como el de mayor incidencia en las identificaciones realizadas, seguidas por los gneros Micrococcus sp y Bacillus sp respectivamente. La disminucin a ms de la mitad de la proporcin de los aislamientos del gnero Bacillus sp es la ms representativa de la actividad del ciclo de desinfectantes empleados, ya que los gneros Micrococcus sp y Staphylococcus sp son provenientes del hombre y su presencia es inevitable en los ambientes donde laboran los operarios, mientras que el gnero Bacillus sp proviene, generalmente, de la presencia de alguna suciedad (16).

CONCLUSIONES

1. La eficacia in situ de los desinfectantes Anios Special DJP SF, Aniosurf Premium, Bacteranios SF, Aniospray 29, Aseptanios AD y Surfanios qued demostrada, ya que logran reducir ms de dos rdenes logartmicos los que tienen accin contra las esporas bacterianas y hongos y ms de tres rdenes logartmicos para los que tienen accin contra bacterias vegetativas

2. Los nuevos desinfectantes logran reducir la carga microbiana presente en las reas de trabajo.

3. La microbiota endgena del rea antes y despus de la implementacin de los desinfectantes no vara en cuanto a los tres gneros detectados, solamente existe una disminucin en la proporcin de los aislamientos del gnero Bacillus sp.

 

REFERENCIAS

1. The International Organization for Standardization. Cleanrooms and associated controlled environments - Part 1: Classification of air cleanliness by particle concentration ISO 14644-1:2015.Geneva: ISO; 2015.

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6. Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos, Buenas Prácticas de Limpieza en la Fabricación de Productos Farmacéuticos e Ingredientes Activos. Anexo No. 11. de la Regulación No. 16-2012. La Habana: CECMED; 2012.

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Recibido: Noviembre de 2016              Aceptado: Enero de 2017

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