Activacin del polisacrido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 23F para la obtencin de vacunas conjugadas

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Activacin del polisacrido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 23F para la obtencin de vacunas conjugadas

 

Activation of the capsular polysaccharide serotype 23F of Streptococcus pneumoniae to obtain conjugate vaccine

 

 

Janoi Chang-Caldern*, Yohanna Serrano-Rodrguez,** Raine Garrido-Arteaga, Jessy Pedroso-Fernndez, Flix Cardoso-San Jorge, Laura Rodrguez-Noda, Darielys Santana-Mederos, Dagmar Garca-Rivero, Yury Valds-Balbn, Vicente Vrez-Bencomo

Instituto Finlay de Vacunas. Ave. 27 No. 19805, La Lisa, La Habana, Cuba.

 

email: yserrano@finlay.edu.cu

* Doctor en Ciencias, Investigador Agregado.

** Maestra en Ciencias, Investigadora Agregada.

 

 


RESUMEN

En la actualidad, las vacunas conjugadas constituyen un gran hito en el desarrollo de frmacos que protegen contra las enfermedades infecciosas. Estas vacunas no solo disminuyen drsticamente la mortalidad y morbilidad de diferentes enfermedades causadas por bacterias en la poblacin infantil; sino que tambin repercuten sobre la poblacin no vacunada. Las vacunas conjugadas se basan en establecer una unin covalente entre un polisacrido y una protena portadora para lo cual existen diferentes procedimientos qumicos. Todos los procedimientos de conjugacin requieren la presencia de grupos reactivos complementarios que muchas veces son generados en ambas macromolculas. Este trabajo se enfoca en el estudio de la reaccin de fragmentacin y de la oxidacin perydica sobre el polisacrido capsular serotipo 23F de Streptococcus pneumoniae para su uso como antgeno vacunal. Se estableci la fragmentacin del polisacrido mediante hidrlisis con cido actico y trifluorocetico. En el caso de la reaccin de oxidacin se encontr que la cantidad de moles de peryodato de sodio y la temperatura influyen de manera directamente proporcional sobre la generacin de grupos carbonilos. Adicionalmente se demostr que el sustituyente glicerol-fosfatos presente en la estructura del serotipo 23F es relevante para conservar la antigenicidad. El procedimiento descrito permite obtener conjugados inmunognicos a partir del polisacrido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 23F en el modelo de conejos.

Palabras clave: Streptococcus pneumoniae, vacunas conjugadas, hidrolisis cida, oxidacin perydica.


ABSTRACT

Nowadays conjugate vaccines are a major milestone in the development of drugs against infectious diseases. These vaccines drastically reduce mortality and morbidity from different diseases caused by bacteria in children; but also impact on non-vaccinated population. Conjugate vaccines are based on a covalent bond between a polysaccharide and a carrier protein for which there are different chemical procedures. All conjugate procedures require the presence of additional reactive groups that often are generated in both macromolecules. This work focus on the study of the fragmentation reaction and peryodic oxidation on the capsular polysaccharide serotype 23F Streptococcus pneumoniae for use as a vaccine antigen. It was possible to establish the fragmentation reaction of the polysaccharide by hydrolysis with acetic and trifluoroacetic acid. Directly proportional ratio was found between numbers of moles of sodium periodate and temperature on the oxidation reactions. In addition the glycerol-phosphate substituent was found as important motif to preserve the antigenicity. The procedure allows immunogenic conjugate from capsular polysaccharide serotype 23F of Streptococcus pneumoniae in rabbit models.

Keywords: Streptococcus pneumoniae, conjugate vaccines, peryodic oxidation, acid hydrolysis.


 

INTRODUCCIÓN

Actualmente las infecciones causadas por Streptococcus pneumoniae tienen un gran impacto sobre la morbilidad y mortalidad infantil, problemtica que es enfrentada con gran efectividad mediante la introduccin de las vacunas conjugadas (1,2). El xito de estas vacunas se sustenta en lograr que el sistema inmune inmaduro de los nios menores de 5 aos responda ante los polisacridos (Ps), antgenos T-independientes, como si fueran antgenos T-dependiente. Esto se logra al establecer un enlace covalente entre el polisacrido bacteriano y una protena portadora (antgenos T-dependientes).

Existen diversos mtodos qumicos que describen la formacin de esta unin covalente entre ambas macromolculas, pero en todos los casos es necesario la presencia de grupos reactivos complementarios (3-5). Las protenas al estar formadas por aminocidos presentan una gran diversidad de grupos reactivos como: grupos aminos, cidos carboxilos, tioles, guanidinio, entre otros. Los polisacridos, por otro lado, presentan menor diversidad de grupos reactivos que la presentada en las protenas. Debido a esto, en muchos casos se introduce una etapa para la activacin de los polisacridos en los procedimientos de conjugacin. Esta etapa de transformacin qumica tiene por objetivo generar grupos ms reactivos en el Ps.

Una de estas reacciones es la disminucin de la talla molecular que permite el uso de los extremos reductores para luego introducir un brazo espaciador (6). Adicionalmente, la disminucin de la talla tambin brinda ventajas tecnolgicas en el trabajo con los Ps como son: un producto con distribucin de talla mejor definida, evitar los problemas de solubilidad y viscosidad de los polisacridos capsulares nativos, y facilitar los procesos de purificacin del producto final (7,8). La oxidacin con peryodato de sodio es un procedimiento muy utilizado para la activacin de los polisacridos. En esta reaccin se forman grupos aldehdos, mediante la oxidacin de dos grupos hidroxilos vecinales que son los ms abundantes en los polisacridos capsulares (PsC), con la consiguiente ruptura del enlace carbono-carbono. Los polisacridos capsulares estn formados por unidades repetitivas que pueden contener uno o varios monosacridos y adems pueden presentar ramificaciones (9).

La reactividad frente a la oxidacin con peryodato en los polisacridos es primeramente sobre los alcoholes primarios, luego los hidroxilos vecinales en configuracin cis y como ltimo los dioles de configuracin trans. Esta susceptibilidad es independientemente a la ubicacin de estos en la estructura del polisacrido, como parte de una ramificacin o dentro de la cadena lineal (10). Por ello, el uso de este procedimiento para la obtencin de antgenos vacunales requiere de un control de las condiciones de la reaccin para evitar afectaciones significativas de la estructura de los polisacridos y con ello la prdida de informacin inmunolgica del polisacrido. El presente trabajo tiene como objetivo establecer un procedimiento para la obtencin de polisacridos fragmentados y activados con grupos aldehdos a partir del polisacrido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 23F. El procedimiento se enfoca en el estudio de la reaccin de disminucin de la talla molecular del polisacrido capsular mediante la hidrlisis cida y la formacin de grupos aldehdos mediante la oxidacin con peryodato de sodio sin afectar la antigenicidad del Ps.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales: La protena toxoide tetnico (TT) lote 6017 suministrada por el Instituto Finlay de Vacunas se obtiene como ingrediente farmacutico activo en el proceso productivo de la vacuna triple bacteriana DPT. En el caso del PsC 23F lote 8001, se obtuvo en el Departamento de Desarrollo Farmacutico del Instituto, cumpliendo con los requisitos recomendados por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) para la produccin de vacunas (11).

Se utilizaron materiales de referencia como el PsC 23F purificado proveniente de la American Type Culture Collection (ATCC) y el suero estndar internacional generado en conejos, especfico contra el serogrupo 23 (23A, 23B y 23F), suministrado por Statens Serum Institute, Copenhagen.

Tcnicas analticas: La cuantificacin de Ps para determinar los rendimientos de las reacciones se realiz mediante la tcnica descrita por Brckner (12) y los grupos carbonilos generados se determinaron a travs del mtodo informado por Porro y cols. (13). En el caso del contenido de protena en los conjugados se emple la tcnica de cuantificacin de protenas en disolucin, descrita por Lowry y cols. (14).

La evaluacin de la identidad de los PsC se realiz mediante la resonancia magntica nuclear protnica (RMN 1H) en un equipo espectrmetro Bruker/Avance DPX 250. El procesamiento de la cada libre de induccin se realiz a travs del software MestReNova. Las muestras se prepararon tomando entre 5-10 mg del producto seco y se disolvieron en 0,6 mL de agua deuterada (D2O, Merck >99.8 %) y se secaron en una liofilizadora (Christ Beta 1-8 LD). Este procedimiento se realiz dos veces antes de disolverlo en agua deuterada para adquirir el espectro, los cuales se adquirieron a una temperatura de 52 C. La determinacin de la constante de distribucin de la talla molecular (KD) se realiz por cromatografa lquida de alta resolucin en columna de exclusin molecular TSK 5000 PW con NaCl 0,9 % como fase mvil y deteccin por ndice de refraccin para el PsC, polisacrido fragmentado (PsFg-23F) y el polisacrido oxidado (PsOX-23F) o deteccin ultravioleta (206 nm) para los conjugados (23F-TT). El anlisis de los datos se realiz a travs del software ClarityChrom.

Preparacin y caracterizacin de los polisacridos y conjugados de 23F

Disminucin de la talla molecular del PsC 23F: A una disolucin que contiene 10 mg de PsC 23F en 2 mL de agua destilada, se le adicion igual volumen de la disolucin del cido en estudio, cido actico (HAc) o cido trifluoroactico (TFA), al doble de la concentracin definida. La mezcla se mantuvo con agitacin a 70 C entre 13 h. Transcurrido este tiempo la reaccin se neutraliz utilizando una disolucin de hidrxido de sodio 0,1 M y la mezcla se purific por membranas de celulosa regenerada de 30, 10 y 1 kDa de porosidad. La eficiencia de la reaccin se determin de acuerdo al contenido de carbohidrato recobrado en las fracciones 10-30 kDa.

Oxidación con peryodato de sodio del PsFg-23F: Se preparó una disolución de Ps fragmentado en disolución tampón fosfato salina pH 7,0 de manera que se obtuvo una concentración de Ps de 4, 10 o 20 mg/mL, según lo definido en la aleatorización del diseño experimental. Luego, se adicionó igual volumen de disolución de NaIO4 que contiene los moles equivalentes establecidos en el diseño. La mezcla de reacción se mantuvo con agitación moderada, protegida de la luz a la temperatura correspondiente. Transcurridas las 3 horas de reacción se añadieron dos equivalentes de glicerol por mol de NaIO4 adicionado. Se conservaron las condiciones de reacción durante 30 min. La mezcla de reacción se purificó mediante ultrafiltración a través de membrana de celulosa regenerada de tamaño de poro 10 kDa.

Conjugación del PsOx-23F a TT mediante aminación–reductiva: La reacción de conjugación se realizó según el procedimiento descrito (15). Solamente se modificó la relación de masa de Ps y proteína que resultó de 1:1 y la concentración de la reacción fue de 10 mg/mL.

Evaluación de la inmunogenicidad: El protocolo en animales, estuvo sujeto al cumplimiento de las normas éticas en la experimentación animal y se aprobó por el Comité de Ética y el Departamento de Calidad de la institución. Se utilizaron conejos blancos de Nueva Zelanda, hembras, de 1,5-1,8 kg de peso (10-12 semanas de edad), procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Se crearon grupos de 5 animales que se inmunizaron con una dosis de 5 μg de Ps contenido en el conjugado o 25 μg de PsC 23F. Además, se incluyó un grupo control al que se le administró suero fisiológico. Las inmunizaciones se realizaron a los 0, 14 y 28 días por vía subcutánea y las extracciones de sangre se realizaron 7 días después de cada inmunización.

Evaluación de memoria inmunológica: A los 120 días, cuando la respuesta de IgG contra el PsC 23F disminuyó, se aplicó una dosis de refuerzo de 25 μg de PsC 23F. Se evaluó la inducción de IgG siete días posteriores a la inmunización. Todos los sueros obtenidos se conservaron a -20 °C hasta su evaluación.

Ensayos de ELISAs

Evaluación del título de IgG contra el PsC 23F: Para evaluar la respuesta de anticuerpos contra el PsC 23F, se siguió un ELISA similar al recomendado por la OMS (16) aunque no fue posible utilizar el sistema de detección por fosfatasa alcalina, sustituyéndose por un conjugado anti conejo-IgG-HRP. Los pasos del ELISA se detallan a continuación: a las placas de 96 pocillos de poliestireno (Maxisorp) recubiertas con 10 µg/mL de PsC 23F (50 µL/pocillo) y bloqueadas con 150 µL/pocillo de disolución de albúmina de suero bovino al 1 %, se les adicionaron los sueros extraídos luego de cada inmunización en diluciones dobles seriadas comenzando por 1/100 en disolución tamponada fosfato salina pH 7,2 más BSA 1 %, EDTA 0,01 M, Tween 20 0,3 %, incubándose durante 90 min a temperatura ambiente. Se adicionó el conjugado anti conejo-IgG peroxidasa (dilución 1/10000) y se incubó durante 90 min a temperatura ambiente. El revelado se realizó adicionando 100 µL/pocillo de orto-fenilendiamina 0,5 mg/mL en disolución citrato (Na2HPO4 52 mM y ácido cítrico 25 mM, pH 5,6) y se mantuvo la placa en oscuridad durante 20 min. Se detuvo la reacción adicionando HCl 3M, se leyó la densidad óptica (DO) a una longitud de onda de 492 nm en un lector de ELISA. Al final de cada incubación se realizó el lavado de las placas con disolución de lavado (disolución tampón fosfato salina pH 7,2, Tween 20 0,05 %).

El cálculo del título de anticuerpos IgG se realizó mediante un análisis de regresión entre los valores de DO y el logaritmo en base 10 del recíproco de la dilución del suero. Para la selección de los animales respondedores, se consideró como valor de corte para la titulación, el doble del valor de absorbancia del suero preinmune (t=0) diluido 1/100, por tanto, el título de anticuerpos se expresó como el log10 de la dilución del suero que dio un valor de DO igual al doble del valor obtenido para el suero preinmune (t=0).

Evaluación de la conservación de la antigenicidad: Para la evaluación de la antigenicidad, se recubrieron las placas en las mismas condiciones que para el ELISA de titulación. Se adicionó el suero de referencia internacional contra el serogrupo 23 (1/6400), disuelto en solución tampón de dilución, previamente incubado durante toda la noche a 4 ºC, con diluciones seriadas 1/10 del PsC en un intervalo de concentraciones de 0,005 µg/mL hasta 500 µg/mL.

El resto del procedimiento se realizó de forma similar a lo descrito para la titulación contra el PsC. Los resultados se muestran como porcentaje de inhibición y se calculó según la siguiente fórmula: 1-[DO (sin inhibidor)-DO (con inhibidor) / DO (sin inhibidor)] X 100.

Anlisis Estadstico

La influencia de la concentracin de PsFg-23F, los equivalentes de NaIO4 y la temperatura en la reaccin de oxidacin con NaIO4 se realiz a travs de un diseo experimental factorial multinivel 3^3 (tabla 1). Se escogieron como variables respuestas; la cantidad de grupos carbonilos introducidos en la estructura del PsFg-23F, expresados como mol de grupo carbonilo por unidad repetitiva (UR), y el rendimiento de la reaccin a travs del recobrado de PsFg-23F. El anlisis estadstico se realiz a travs del programa estadstico de computacin Statgraphics Centurion XV (StatPoint Inc. 1982-2007), se consider significacin estadstica para p = 0,05. Las diferencias en la respuesta de anticuerpos IgG anti-PsC 23F entre los distintos grupos experimentales se realiz mediante la aplicacin de la prueba de Kruskal Wallis (no paramtrico) y la prueba de Dunn a posteriori. Las diferencias se consideraron significativas para p = 0,05. El procesamiento estadstico de los datos de todos los experimentos se realiz con el programa GraphPad Prism, versin 4.00.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterizacin del PsC 23F mediante RMN 1H

La identidad del PsC de Streptococcus pneumoniae serotipo 23F se realiz mediante RMN 1H. Se apreciaron las seales correspondientes a los grupos metilos de la a-L-ramnosa y -L-ramnosa a 1,26 y 1,36 ppm respectivamente. Adems, se identificaron las seales correspondientes a los cuatro anomricos a 4,83; 4,85; 4,93 y 5,1 ppm lo cual coincide con lo reportado en la caracterizacin de la unidad repetitiva del serotipo 23F por RMN 1H y con el espectro registrado para el PsC 23F ATCC de referencia. Adicionalmente se obtuvo un Ps de 23F sin sustituyente glicerol-fosfato segn lo descrito por James Richards en 1988 (17) para utilizarlo como referencia de afectacin del sustituyente glicerol-fosfato en los ensayos de identidad por RMN 1H y de antigenicidad por ELISA.

Obtencin del PsFg-23F mediante hidrlisis cida

La fragmentacin de los PsC se implementa mediante mtodos fsicos, mecnicos y qumicos. La disminucin de la talla del PsC 23F se estudi mediante hidrlisis cida y se evaluaron dos tipos de cidos en diferentes condiciones. Los resultados muestran que tanto con HAc como TFA se obtienen PsFg-23F con tallas entre 10-30 kDa, aunque los mejores rendimientos (84 %) se alcanzaron con TFA (tabla 2). Al ser el TFA un cido ms fuerte se requiere de un menor tiempo, as como de una menor temperatura de reaccin. Estos resultados son comparables con los reportados para la reduccin de la talla molecular de polisacridos de neumococo por hidrlisis cida en cuanto a la eficiencia del TFA (19).

Un requisito muy importante al modificar los PsC para utilizarlos como antígenos de vacunas conjugadas es lograr conservar los epítopes B. La unidad repetitiva del PsC 23F presenta dos ramificaciones, un residuo de L-ramnosa que debe ser conservado ya que es un determinante antigénico, lo cual se demostró con sueros de conejos, de caballos y humanos (20). La otra ramificación es un sustituyente glicerol-fosfato de la cual no encontramos información sobre su importancia inmunológica. Ambas ramificaciones pueden sufrir hidrólisis con TFA (21) y de ser eliminadas pueden causar afectación de la antigenicidad del PsFg-23F.

Los espectros de RMN 1H de los PsFg-23F obtenidos con ambos ácidos mostraron que todos conservaron la identidad de la unidad repetitiva al compararse con el espectro del PsC 23F, excepto cuando se utilizó TFA 0,25 M (figura 1A). En el espectro correspondiente se aprecia una señal en δ 5,12 ppm característica de la ausencia del sustituyente glicerol-fosfato (figura1B) y que se corresponde con la α-L-ramnosa según lo reportado por Richards en 1988 (17).

La antigenicidad se evaluó mediante un ELISA de inhibición, para lo cual se utilizó un suero de referencia específico contra el serogrupo 23. Las curvas de inhibición registradas con los diferentes fragmentos presentaron similitud a la obtenida para el PsC 23F, excepto para los fragmentos con afectaciones del sustituyente glicerol-fosfato (figura 2).

El PsC 23F sin sustituyente glicerol-fosfato obtenido como referencia del estudio no es capaz de inhibir al suero específico en un 100 %, y el PsFg-23F (0,25M de ácido trifluoroacético) con afectación parcial del sustituyente glicerol-fosfato necesitó más de 10 veces la concentración para alcanzar el 50% de inhibición en comparación con el resto de los derivados evaluados (figura 2). En nuestro caso, todos los fragmentos obtenidos se encuentran en el mismo intervalo de tallas moleculares (KD), luego, la disminución de la antigenicidad está directamente relacionada con la afectación del sustituyente glicerol-fosfato. Este resultado indica que el glicerol-fosfato juega un rol fundamental en la antigenicidad del serotipo 23F, lo cual ha sido observado para el serotipo 18C de neumococo donde este sustituyente es un elemento importante en el reconocimiento por parte del sistema inmune (18).

Obtencin del PsOx-23F mediante la oxidacin con NaIO4

La unidad repetitiva del PsC 23F presenta varios sitios posibles de ser oxidados, algunos de los cuales se localizan en el residuo de L-ramnosa de la cadena lateral, descrita como determinante antigénico (19). Con el objetivo de tener mayor conocimiento de la reacción de oxidación con NaIO4 se realizó un diseño experimental multifactorial 3^3. El análisis estadístico arrojó que los parámetros equivalentes de NaIO4 (p=0,000 para ambas variables) y la temperatura (p=0,0036 para nivel de oxidación y p=0,0001 para el rendimiento) influyen de manera significativa sobre el nivel de oxidación y los rendimientos obtenidos, aunque los equivalentes de NaIO4 presentan mayor significación. De manera inesperada los resultados mostraron que la variación de la concentración de Ps en la reacción no influyó en ninguna de las variables evaluadas. Tanto los equivalentes de NaIO4 como la temperatura tienen una relación directa con la generación de grupos aldehído (p= 0,0018).

Además, se realizó una evaluación de la conservación de la identidad y la antigenicidad sobre los PsOx-23F. Al comparar los espectros de RMN 1H de PsOx-23F con diferentes contenidos de grupos carbonilos se observó afectación de la identidad de la UR del PsC 23F (figura 3). A medida que aumentó el número de grupos carbonilos generados, los espectros de RMN 1H presentaron menor resolución. El análisis espectroscópico muestra una disminución de la intensidad relativa de la señal correspondiente al grupo metilo de la α-L-ramnosa (δ 1,26 ppm) y un aumento de las señales a δ 1,20; 2,04; 2,14 y 5,20 ppm, respectivamente. Se puede relacionar la señal de 1,20 ppm con el grupo metilo de la ramnosa lateral oxidada y la señal de δ 5,20 ppm con el carbono anomérico de este sustituyente. El conjunto de modificaciones apreciadas evidencian que desde la generación de un carbonilo cada 2,5 UR existe afectación de la identidad de la UR en el PsOx-23F. Por otro lado, a medida que se aumenta la oxidación sobre el Ps 23F ocurre afectación de la antigenicidad, la cual es marcada en el máximo nivel de activación evaluado (C = O:1 UR) (figura 4), por lo que se aprecia una correspondencia con los resultados obtenidos en el análisis espectroscópico. Lo anterior indica que la disminución de la antigenicidad se debe a la oxidación excesiva del residuo de α-L-ramnosa, donde se encuentran los sitios más susceptibles a la oxidación (20) y al mismo tiempo es un determinante antigénico (21).

Se realizaron 5 réplicas de las condiciones de oxidación para obtener un grupo carbonilo entre 5-7 UR. Se obtuvo un rendimiento promedio de 76,4 %; un nivel de oxidación de un grupo carbonilo cada 6,2 y una KD promedio de 0,55. El espectro del PsOx-23F mostró todas las señales características del PsC 23F natural. Además, se observan los cuatros protones anoméricos, con intensidades relativas similares a las del PsFg-23F, que indica que se conservó la cadena lateral.

Por otro lado no se observaron señales relacionadas con la afectación del sustituyente glicerol-fosfato, el cual es imprescindible para mantener la antigenicidad del PsC 23F. No obstante, se apreciaron nuevas señales a δ 1,20; 2,04; 5,20; 6,59 y 9,22 ppm, aunque todas con baja intensidad relativa. Estos corrimientos químicos están relacionados con los cambios estructurales que provocaron la generación de los grupos carbonilos en la estructura del PsOx-23F como se describió anteriormente.

Conjugacin del PsOx-23F a la protena portadora toxoide tetnico

Se seleccionó un PsOx-23F con un carbonilo cada 6 UR y se conjugó a la proteína portadora TT mediante la reacción de aminación reductiva para conocer si estos podían inducir una respuesta inmune específica contra el PsC 23F. Las caractersticas de los conjugados obtenidos fueron: un recobrado superior al 48 %, una relacin carbohidrato: protena en el intervalo de 1,1:1 hasta 1:1,2 y un porcentaje de protena no conjugada promedio de 12,5 %, determinada en columna SUPEROSA 12.

Todos los valores obtenidos de la relacin carbohidrato: protena se encuentran incluidos en el intervalo recomendado por la OMS para la obtencin de vacunas conjugadas de neumococo (11). Adems, el anlisis en cromatografa lquida de alta resolucin en columna de exclusin molecular arroj una KD de 0,33 en columna TSK 5000. Los ttulos de IgG contra el PsC 23F inducido por el conjugado fueron superiores con significacin estadstica a los inducidos por el grupo inmunizado con PsC 23F luego de la segunda y tercera dosis (figura 5). Por otro lado, el conjugado increment la generacin de IgG despus de cada inmunizacin, aunque solo fue estadsticamente significativa luego de la segunda dosis.

Siete das posteriores a la inmunizacin con polisacrido capsular, se observ un incremento significativo de los ttulos de IgG, solo en el grupo previamente inmunizado con conjugado. Esto indica que la respuesta inmune generada por los conjugados fue capaz de inducir memoria inmunolgica, que supone la presencia de poblaciones especficas al PsC de clulas B de memoria, lo cual es caracterstico de antgenos de tipo T dependientes.

Los resultados experimentales permiten concluir que se puede utilizar la hidrlisis cida para la fragmentacin del PsC 23F de manera que se conserve la identidad de la UR y la antigenicidad del Ps. El sustituyente glicerol-fosfato presente en el PsC 23F es importante para el reconocimiento por los anticuerpos, por lo cual debe ser conservado. La oxidacin perydica sobre el polisacrido 23F debe ser controlada para evitar la disminucin de la antigenicidad por la afectacin del residuo de L-ramnosa. Los conjugados obtenidos por esta va generan una respuesta T-dependiente especfica contra el polisacrido capsular serotipo 23F.

 

REFERENCIAS

1. Simonsen L, Taylor RJ, Young-Xu Y, Haber M, May L, Klugman KP. Impact of pneumococcal conjugate vaccination of infants on pneumonia and influenza hospitalization and mortality in all age groups in the United States. MBio 2011;2:e00309-10.

2. Pilishvili T, Lexau C, Farley M, Hadler J, Harrison L, Bennett N, et al. Sustained reductions in invasive pneumococcal disease in the era of conjugate vaccine. J Infect Dis 2010;201:32-41

3. Lees A, Nelson B, Mond J. Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluroborate for use in proteinpolysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. Vaccine 1996;14:1908.

4. Gildersleeve J, Oyelaran O, Simpson J, Allred B. Improved Procedure for Direct Coupling of Carbohydrates to Proteins via Reductive Amination. Bioconjug Chem 2008;19(7):1485-90.

5. Paterson G, DunKan J. Recent advances in the field of Salmonella Typhi vaccines. Human Vaccine 2010;6(5):379-84.

6. Qingrui H, Dongxia L, Aijun K, Wenqi A, Bei F, Xiaowei M, et al. PEG as a spacer arm markedly increases the immunogenicity of meningococcal group Y polysaccharide conjugate vaccine. Journal of Controlled Release 2013;172:382-9.

7. Pawlowski A, Kallenius G, Svenson S. Preparation of pneumococcal capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines utilizing new fragmentation and conjugation technologies. Vaccine 2000;18(18):1873-85.

8. Soubal J, Pea L, Santana D, Valds Y, Garca D, Pedroso J, et al. Procedure for the conjugation of the Streptococcus pneumoniae serotype 6B capsular polysaccharide to the tetanus toxoid. Biotecnologa Aplicada 2013;30:208-15.

9. Kamerling J. Pneumococcal polysaccharides: A chemical view. En: Tomasz A, editor. Streptococcus pneumoniae: molecular biology and mechanisms of disease. New York: Mary Ann Lierbert, Inc.; 2000. p.8593.

10. John S, Laskowich E, Michon F, Kaiser R, Arumugham R. Monitoring activation sites on polysaccharides by GCMS. Anal Biochem 2006;358(1):136-42.

11. World Health Organization. Recommendations for the production and control of pneumococcal conjugate vaccine. Technical Report Series No 927. Geneva: WHO; 2005.

12. Bruckner J. Estimation of monosaccharides by the orcinol-sulfuric acid reaction. Biochemical Journal 1995;60:200-5.

13. Porro M, Vitti S, Antoni G, Neri P. Modifications of Park-Johnson ferricyanide submicromethod for the assay of reducing groups in carbohydrates. Anal Biochem. 1981;118:301-6.

14. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951;193:265-75.

15. Chang J, SerranoY, Garrido R, Pedroso J, Cardoso F, Garca D, et al. Caracterizacin de conjugados inmunognicos de polisacrido capsular Streptococcus pneumoniae serotipo 14. VacciMonitor 2013;22(1):15-21.

16. World Health Organization. Training Manual for Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Quantitation of Streptococcus pneumoniae Serotype-Specific IgG (Pn Ps ELISA). London: World Health Organization Pneumococcal Serology Reference Laboratories; 2016. Disponible en: https://www.vaccine.uab.edu/ELISA%20protocol.pdf.

17. Richards J, Perry M. Structure of the specific capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 23F (American type 23). Biochem Cell Biol 1988;66:758-71.

18. Chang J, Serrano Y, Garrido R, Rodrguez L, Pedroso J, Cardoso F, et al. Relevance of O-Acetyl and phosphoglycerol groups for the antigenicity of Streptococcus pneumoniae serotype 18C capsular polysaccharide. Vaccine 2012;30:7090-6.

19. Park S, Nahm M. L-rhamnose is often an important part of immunodominant epitope for pneumococcal serotype 23F polysaccharide antibodies in human sera immunized with PPV23. PLoSOne 2013;8:e83810. doi: 10.1371/journal.pone.0083810.

20. Charlotte C, Yu I, Manam V, Hepler R, PHennessey J. Carbohydrate composition analysis of bacterial polysaccharides: optimized acid hydrolysis conditions for HPAEC-PAD analysis. Anal Biochem 1992;201:343-9.

21. Kim J, Laskowich E, Michon F, Kaiser R, Arumugham R. Monitoring activation sites on polysaccharides by GC-MS. Anal Biochem. 2006;358:136-42.

 

Recibido: Noviembre de 2016              Aceptado: Enero de 2017

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