Dot Blot para determinar la identidad antigénica en vacunas conjugadas contra Streptococcus pneumoniae serotipo 19F

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Dot Blot para determinar la identidad antigénica en vacunas conjugadas contra Streptococcus pneumoniae serotipo 19F

 

Dot Blot to determine the antigenic identity in conjugated vaccines against Streptococcus pneumoniae serotype 19F

 

 

Osmir Cabrera-Blanco*, Mnica Pisonero-Triana, Mercedes Rodrguez-Bejerano, Rocmira Prez-Nicado, Elizabeth Gonzlez-Aznar, Laura M. Rodrguez-Noda, Jessy Pedroso-Fernndez, Dagmar Garca-Rivera

Instituto Finlay de Vacunas. Ave. 27 No. 19805, La Lisa, La Habana, Cuba.

 

email: ocabrera@finlay.edu.cu

* Investigador Titular; Dr. Ciencias Qumicas.

 

 


RESUMEN

Las autoridades regulatorias recomiendan el uso de tcnicas de Resonancia Magntica Nuclear o tcnicas serolgicas para la determinacin de la identidad de los antgenos presentes en las vacunas conjugadas. Con la aparicin de las vacunas conjugadas multivalentes, se ha hecho necesario recurrir a tcnicas inmunoqumicas con la utilizacin de anticuerpos monoclonales para aumentar la sensibilidad en la determinacin de la identidad de los antgenos en dichas vacunas conjugadas. El objetivo del presente trabajo fue establecer las condiciones ptimas de trabajo que permitieran utilizar la tcnica del Dot Blot para determinar la identidad de los antgenos en vacunas conjugadas de Streptococcus pneumoniae serotipo 19F. Para ello se estudiaron los tiempos de incubacin, la influencia del reactivo en la solucin de bloqueo; tambin las concentraciones ptimas del anticuerpo monoclonal y de los ingredientes farmacuticos activos, as como los volmenes de aplicacin ptimos para estos y vacunas. Se utiliz un anticuerpo monoclonal contra el polisacrido capsular del serotipo 19F de neumococo. Las muestras empleadas en este trabajo fueron lotes de ingredientes farmacuticos activos de conjugados de polisacrido capsular 19F y lotes de un candidato vacunal cubano conjugado heptavalente contra neumococos. Los resultados mostraron que para la determinacin de la identidad antignica fueron suficientes 10 L de muestras de los principios activos a una concentracin de 125 g/mL e igual volumen para las vacunas heptavalentes. Qued demostrado que una concentracin de 1 g/mL para el anticuerpo monoclonal y tiempos de incubacin de 30 min a 37 C fueron suficientes para la determinacin. Estos resultados permiten concluir que quedaron establecidas las condiciones ptimas de trabajo para determinar la identidad antignica por Dot Blot del polisacrido capsular de S. pneumoniae serotipo 19F presente en las vacunas conjugadas.

Palabras clave: Dot Blot, anticuerpos monoclonales, Streptococcus pneumoniae.


ABSTRACT

Regulatory authorities recommend the use of NMR (Nuclear Magnetic Resonance) techniques or serological techniques to determine the identity of antigens on the conjugate vaccines. Due to the emergence of multivalent conjugate vaccines it has become necessary to use immunochemical techniques with the use of monoclonal antibodies (MAbs) in order to increase the sensitivity in determining the identity of such antigen in the conjugate vaccines. The aim of this study was to establish the optimal working conditions that would allow using Dot Blot technique to determine the identity of antigens in conjugate vaccines against Streptococcus pneumoniae serotype 19F. The incubation times, the possibility of using different reagents for blocking step were studied for this purpose; also the optimal concentrations of MAbs and active pharmaceutical ingredients (APIs), as well as the volumes of optimal application for APIs and vaccines. A monoclonal antibody against the capsular polysaccharide of S. pneumoniae serotype 19F (PsC 19F) was used. The samples used in this work, were samples of lots of APIs of monovalent conjugated PsC 19F and lots of Cuban heptavalent conjugate vaccine candidate against pneumococcus. The results showed that for the determination of the antigenic identity were optimal volumes of 10 L of monovalent conjugate samples at 125 g/mL and equal volume for heptavalent vaccines. For MAb was demonstrated that 1 g/mL concentration of MAb against the PSC 19F and incubation times of 30 min at 37 C were sufficient to successfully perform the determinations. In conclusion we can say that were established optimal working conditions to determine the antigenic identity, by Dot Blot, for the capsular polysaccharide of S. pneumoniae serotype 19F present in the APIs of monovalent conjugated and in the heptavalent conjugate vaccines.

Keywords: Dot Blot, monoclonal antibody, S. pneumoniae.


 

INTRODUCCIÓN

La infeccin por Streptococcus pneumoniae puede presentarse con muchas manifestaciones clnicas incluyendo meningitis, septicemia, bacteriemia, neumona, otitis media aguda y sinusitis. Estas infecciones han causado gran morbilidad y mortalidad en todo el mundo, especialmente en los nios. La infeccin neumoccica cada ao ha causado aproximadamente 14,5 millones de casos de enfermedad neumoccica invasiva (ENI) y 0,7-1 millones de muertes en nios menores de cinco aos de edad, sobre todo en pases en desarrollo y subdesarrollados (1).

Al menos 93 diferentes serotipos de S. pneumoniae han sido identificados basados en la reactividad cruzada de anticuerpos contra los polisacridos capsulares. Aunque solamente un limitado grupo de serotipos son frecuentemente aislados de pacientes con neumona, el desarrollo de una vacuna universal basada en los polisacridos contra todas las infecciones con S. pneumoniae se ve obstaculizada por la especificidad de los anticuerpos y las variaciones de los serotipos prevalentes entre las diferentes poblaciones de reas geogrficas y demogrficas (2). Una vacuna neumoccica polisacardica 23-valente, que contena a los polisacridos capsulares (PsC) de los 23 serotipos ms predominantes que representaban el 88 % de los casos de ENI, fue desarrollado en 1983 (3). Esta induce una respuesta inmune timo independiente y mostr una eficacia de 56-81 % en varios ensayos clnicos (4). Posteriormente se desarroll una vacuna conjugada heptavalente para proporcionar proteccin contra la infeccin de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) que eran responsables de aproximadamente el 80 % de los casos de ENI en los nios pequeos en los Estados Unidos (5).

Uno de los requerimientos de los organismos regulatorios para la liberacin de los lotes de vacunas para ser utilizadas en humanos, es la determinacin de la identidad antignica de los componentes vacunales, la cual puede determinarse por mtodos serolgicos con el uso de anticuerpos especficos a los PsC en cuestin o por tcnicas de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) (6).

Con el surgimiento de las vacunas conjugadas combinadas ha surgido también un reto para los laboratorios que se ocupan del control de calidad de dichas vacunas, ya que las mismas cuentan en su composición con varios polisacáridos, que en muchas ocasiones presentan estructuras químicas similares, lo que imposibilita tanto determinar la identidad antigénica por las técnicas de RMN, como cuantificarlos por las tradicionales técnicas colorimétricas empleadas; además de que las bajas concentraciones de los antígenos vacunales en la formulación final están por debajo de los límites de detección de estas técnicas.

Las técnicas inmunoquímicas son cada día más utilizadas en el control de calidad de las vacunas y más aún en las vacunas conjugadas, siendo las más utilizadas los ELISA y los Western Blot, debido a su sensibilidad que permite detectar bajas concentraciones de los antígenos en las formulaciones vacunales.

El Instituto Finlay de Vacunas, centro dedicado a la investigación, desarrollo y producción de estos fármacos, se encuentra trabajando en la obtención de una vacuna conjugada contra neumococos. Este candidato vacunal contiene siete ingredientes farmacéuticos activos (IFAs) de PsC de S. pneumoniae de los serotipos 1, 5, 6B, 14, 18C, 19F y 23F, enlazados covalentemente al toxoide tetánico (TT) como proteína portadora y adsorbidos en fosfato de aluminio como adyuvante (7,8).

El objetivo del presente trabajo fue establecer las condiciones analíticas que permitieran utilizar la técnica del Dot Blot y un anticuerpo monoclonal (AcM) para determinar la identidad del PsC de S. pneumoniae serotipo 19F (PsC 19F) en IFAs y en vacunas conjugadas multivalentes.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras

a) Anticuerpos monoclonales: El AcM murino anti polisacrido capsular de S. pneumoniae serotipo 19F utilizado fue el 177/10/27/11 (Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB), Habana, Cuba).

b) Muestras: Para establecer las condiciones de trabajo en el desarrollo del Dot Blot para la identidad del PsC 19F, se utilizaron muestras de los lotes 19F-1202, 19F-1301 y 19F-1501 de IFAs del PsC conjugado a TT y muestras de los lotes Neu-1001, Neu-1101, Neu-1302 y Neu-1303 del candidato vacunal conjugado heptavalente; as como muestras de lotes de IFA de otros serotipos de S. pneumoniae presentes o no en el candidato vacunal heptavalente (1, 5, 6B, 14, 18C, 23F, 7F, 9V y 19A). Las protenas TT, toxoide diftrico (TD) y la albmina de huevo (OVA) tambin fueron incluidos en el estudio. Todas las muestras empleadas fueron obtenidas en el Instituto Finlay de Vacunas en condiciones de Buenas Prcticas de Manufactura, excepto la OVA (SIGMA, USA).

Dot Blot

Para la realizacin del Dot Blot, se utiliz un equipo Minifold II S&S (Alemania) acoplado a bomba de vaco y se emple membrana de nitrocelulosa (MNC) de 0,45 m (Bio-Rad, EUA). Se realizaron varios Dot Blot con los siguientes objetivos: determinar el tiempo de incubacin; determinar la influencia del reactivo en la solucin de bloqueo; determinar las concentraciones ptimas de AcM y de IFAs; determinar los volmenes de aplicacin ptimos para las IFAs y vacunas y para probar las condiciones establecidas en la identidad del PsC 19F en varios lotes de IFAs y vacunas. Para todos los estudios realizados se utiliz la membrana previamente remojada en Solucin Salina Tamponada con Fosfatos 0,15 M, pH 7,2 (SSTF) (9).

Determinacin del tiempo de incubacin

Para la realizacin de este estudio fueron aplicados en la MNC bajo presin de vaco, 100 L de una IFA de un conjugado monovalente del PsC 19F con TT (lote 19F-1301) a una concentracin de 250 g/mL. Posteriormente se extrajo la membrana del equipo y se procedi al bloqueo de los sitios activos remanentes con SSTF y leche descremada (LD) al 3 % durante 30 min a 37 C. Despus de tres lavados de 5 min cada uno con SSTF/Tween 20 al 0,05 %, se recort la MNC en 2 tiras (una tira para cada tiempo de incubacin) y fueron incubadas con el AcM anti PsC 19F a una concentracin de 10 g/mL en LD al 1 % en SSTF, durante 1 h a temperatura ambiente o 30 min a 37 C. Seguidamente las membranas fueron lavadas en la solucin de lavado de la misma forma. Posterior a los lavados las MNC fueron incubadas con anti IgG de ratn conjugado a peroxidasa (Sigma, USA), a una dilucin de 1:5000 en SSTF-LD 1 %, 1 h a temperatura ambiente o 30 min a 37 C. Posteriormente se realizaron 5 lavados de 3 min y se procedi al revelado, para lo cual se cubri cada tira con SSTF/3,3-tetrahidrocloro diaminobenzidina (DAB) al 0.04 % y perxido de hidrgeno (H2O2) al 0,5 %, durante 10 min. La reaccin se detuvo realizando varios cambios con agua destilada.

Determinar la influencia del reactivo en la solucin de bloqueo

Para la realizacin de este estudio fueron aplicadas 100 L de las muestras en las mismas condiciones que para el estudio anterior y tambin fue utilizada la misma muestra (IFA 19F-1301). Posteriormente se extrajo la membrana del equipo y se cort en tres tiras (una tira por cada solucin de bloqueo) para realizar el proceso de bloqueo de los sitios activos remanentes, para lo cual se utiliz LD, Gelatina y Albmina Srica Bovina (BSA). Cada reactivo fue disuelto por separado al 3 % en SSTF, el proceso de incubacin se llev a cabo durante 30 min a 37 C. Despus de tres lavados de 5 min cada uno con SSTF/Tween 20 al 0,05 %, fueron incubadas las tres MNC durante 30 min a 37 C con el AcM anti polisacrido capsular de S. pneumoniae serotipo 19F a 2 g/mL diluido en LD, o gelatina o BSA (segn corresponda) al 1 % en SSTF durante 30 min a 37 C. Pasado el tiempo de incubacin las membranas fueron lavadas de igual manera y seguidamente fueron incubadas por 30 min a 37 C con anti IgG de ratn conjugado a peroxidasa (Sigma, USA) a una dilucin de 1:5000, diluido en LD, gelatina o BSA (segn corresponda) al 1 % en SSTF. Posteriormente se realizaron 5 lavados de 3 min y se procedi al revelado, para lo cual se cubri cada tira con SSTF/DAB al 0,04 % y H2O2 al 0,5 %, durante 10 min. La reaccin se detuvo realizando varios cambios con agua destilada.

Determinar las concentraciones ptimas del anticuerpo monoclonal y de las muestras de monovalentes conjugados

Como muestra antignica se utiliz el mismo lote de IFA empleada en los acpites anteriores (19F-1301). Se aplic 100 L en la MNC al vaco y por triplicado, haciendo diluciones dobles seriadas a partir de una concentracin de 250 g/mL hasta 1 g/mL. El paso del bloqueo se realiz con LD al 3 % en SSTF, mientras que la incubacin y lavados se realizaron igual a lo descrito en el acpite anterior. Posteriormente se cort la membrana en tres tiras (una tira para cada concentracin del AcM). Se utilizaron tres concentraciones diferentes (10, 2 y 1 g/mL en LD al 1 % en SSTF) del AcM contra el polisacrido capsular del neumococo 19F. El resto de la tcnica se realiz segn lo descrito en el acpite anterior.

Determinar los volmenes de aplicacin ptimos para las IFAs y vacunas

Para este estudio fueron inmovilizados en una tira de MNC 10, 20, 50 y 100 L de la IFA 19F-1301, ajustada previamente a una concentracin de 125 g/mL y fueron tomados iguales volmenes para el candidato vacunal conjugado heptavalente (lote Neu 1302), los cuales fueron tomados directamente del bulbo (4 g/mL) sin dilucin previa; estas muestras de vacuna fueron inmovilizados en otra tira de MNC. La concentracin del AcM empleada en este ensayo fue 1 g/mL. El resto de la tcnica sigui el procedimiento ya descrito.

Prueba de identidad del polisacrido capsular de S. pneumoniae serotipo 19F en lotes de IFAs y vacunas

Una vez que contamos con todos los parmetros de la tcnica ajustados, escogimos tres lotes de IFAs del conjugado monovalente de neumococo 19F (lotes: 19F-1202, 19F-1301 y 19F-1501) de los cuales fueron aplicados 50 L bajo vaco y previamente ajustados a una concentracin de 125 g/mL en una MNC. Tambin fueron aplicadas en la MNC una muestra de 50 L de lotes de IFAs de conjugados monovalentes de otros serotipos de neumococo (1, 5, 6B, 14, 18C, 23F, 7F, 9V y 19A), todas previamente ajustadas a una concentracin de 125 g/mL, as como muestras de las protenas TT, TD y OVA a una concentracin de 0,5 mg/mL. En otra tira de MNC fueron inmovilizados 20 L de cuatro lotes del candidato vacunal conjugado heptavalente contra S. pneumoniae (lotes: Neu-1001, Neu-1101, Neu-1302 y Neu-1303) sin dilucin previa. El resto de la tcnica se realiz segn los resultados obtenidos en los acpites anteriores.

Captura de las imgenes

Las imgenes de los Dot Blot fueron capturadas utilizando un densitmetro GS-800 (Bio-Rad, EUA) con software de captura y cuantificacin (Quantity One).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Determinacin del tiempo de incubacin

El primer parmetro que se estudi en este trabajo fue el tiempo de incubacin empleado en los pasos de incubacin con los anticuerpos, tanto el AcM anti PsC 19F como el anti IgG de ratn conjugado a peroxidasa ya que eran los pasos del proceso que duraban 1 hora cada uno. En la Figura 1 se muestran los resultados del estudio. Como puede observarse, para los dos tiempos estudiados se obtiene una mancha bien definida como una seal de que el PsC 19F est siendo reconocido por el AcM anti PsC 19F. La mayor intensidad de la mancha aparece cuando empleamos 1 h, mientras que al disminuir el tiempo de incubacin se puede observar una ligera disminucin de la intensidad de la coloracin de las manchas, aunque suficiente para poder detectar al antgeno en la muestra analizada. Dentro de los parmetros que pueden afectar la intensidad de la coloracin de la mancha podemos encontrar los tiempos de exposicin entre los antgenos y los anticuerpos y el tiempo de revelado (10). En este trabajo se demostr que con 30 min de incubacin a 37 C, se obtienen manchas de reconocimiento antgeno-anticuerpo que evidencian la presencia del PsC 19F en las IFAs y en las vacunas conjugadas multivalentes.

 

Determinar la influencia del reactivo en la solucin de bloqueo

Los resultados obtenidos de la influencia de la gelatina, la BSA y la LD en el Dot Blot, se muestran en la Figura 2. Podemos observar que para las tres soluciones de bloqueo se obtuvieron manchas de coloracin intensa que evidencian el reconocimiento antignico en la muestra. Tambin se puede observar que para las soluciones de gelatina y BSA a pesar de ser evidente la mancha de reconocimiento del PsC 19F por parte del AcM, se obtiene un fondo oscuro en la MNC alrededor de la mancha, lo cual no se observa con la LD, esto puede deberse a que el bloqueo de los sitios inespecficos en la MNC con gelatina y BSA fue menos eficiente que el bloqueo logrado con la LD.

En las tcnicas inmunoqumicas como ELISA o Dot Blot, es muy comn emplear reactivos como la gelatina (11), la BSA (12,13) o LD (9) con la finalidad de bloquear los sitios activos remanentes despus de fijado el antgeno en el soporte empleado para la tcnica. Est descrito que la eficiencia de bloqueo para cada uno de estos reactivos va a depender de varios factores, por lo que hay que tener en cuenta la eleccin del mismo a la hora de desarrollar un mtodo inmunoqumico (11). Segn los resultados obtenidos podemos plantear que a pesar de ser ms eficiente el bloqueo de los sitios inespecficos con LD, pueden emplearse tambin la BSA o la gelatina como solucin de bloqueo, para la determinacin de la identidad antignica del PsC 19F usando las mismas muestras y condiciones aplicadas en este trabajo.

 

Determinar las concentraciones ptimas del anticuerpo monoclonal y de las muestras de monovalentes conjugados

Los resultados obtenidos en la determinacin de las concentraciones ptimas del anticuerpo monoclonal y de las muestras de monovalentes conjugados se muestran en la Figura 3. Se puede observar la presencia de manchas de reconocimiento antignico para las diluciones de las muestras desde 250 g/mL y hasta 4 g/mL, aprecindose una disminucin de la intensidad de la mancha a medida que disminuye la concentracin de la muestra, hasta que a las concentraciones de 2 y 1 g/mL no se observa la mancha de reconocimiento del AcM por el PsC presente en la muestra.

Con relación a la variación de la concentración del AcM, las manchas oscuras se comienzan a observar a partir de los 4 µg/mL de la IFA, aumentando la intensidad de la señal con el incremento de la concentración del AcM empleado, llegando a ser la concentración de 10 μg/mL de AcM y 250 μg/mL de la IFA, donde se observó la mancha con mayor intensidad de color. Teniendo en cuenta los resultados anteriores, decidimos recomendar las concentraciones de 125 μg/mL de la IFA y 1 μg/mL de este AcM como las condiciones de concentraciones óptimas de reconocimiento.

Determinar los volmenes de aplicacin ptimos para las IFAs y vacunas

Los resultados obtenidos en este experimento se muestran en la Figura 4. Las manchas oscuras evidencian el reconocimiento antignico para todos los volmenes estudiados tanto para la IFA como para el candidato vacunal, sin observarse diferencias entre los mismos. Otro aspecto importante a tener en cuenta en un Dot Blot, es el volumen de muestra aplicada en el paso de inmovilizacin, este aspecto es de particular importancia cuando estamos trabajando con muestras de formulaciones vacunales que se encuentran en bajas concentraciones y sobre todo cuando el antgeno de inters est en presencia de otros antgenos con estructuras semejantes, como es el caso de las vacunas conjugadas multivalentes contra neumococos. El resultado obtenido en este estudio nos sugiere que podemos utilizar hasta un volumen de 10 L de estos tipos de muestras (IFAs y vacunas).

Prueba de identidad del polisacrido capsular de S. pneumoniae serotipo 19F en lotes de IFAs y vacunas

Los resultados obtenidos como prueba de identidad por Dot Blot con las condiciones de trabajo establecidas en este estudio se muestran en la Figura 5. Para todas las muestras donde estaba presente el PsC 19F se obtuvo una mancha oscura como reconocimiento del mismo por parte del AcM y como era de esperar, no apareci la mancha en los pozos donde fueron aplicadas muestras de lotes de las IFAs de los conjugados monovalentes de otros serotipos de S. pneumoniae, ni en los pozos donde fueron aplicadas las muestras de las protenas. Este resultado es una evidencia de la especificidad de este AcM, que incluso es capaz de discernir entre el 19F y el 19A a pesar de su similitud estructural (Tabla 1). Con el surgimiento de las vacunas conjugadas combinadas ha surgido tambin un reto para los laboratorios que se ocupan del control de calidad de dichas vacunas, ya que las mismas cuentan en su composicin con varios polisacridos, que en muchas ocasiones presentan estructuras qumicas similares, lo que imposibilita cuantificarlos por las tcnicas colorimtricas tradicionales empleadas; adems de que las bajas concentraciones de los antgenos vacunales en la formulacin final, estn por debajo de los lmites de deteccin de estas tcnicas colorimtricas. Por la misma razn se hace difcil el empleo de tcnicas de RMN para determinar la identidad antignica de los componentes vacunales. Una posible solucin para estos problemas es la utilizacin de tcnicas de ELISA que empleen AcM especficos contra los antgenos a evaluar.

 

REFERENCIAS

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Recibido: Noviembre de 2016              Aceptado: Diciembre de 2016

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